专利名称：醋酸格拉默分子量标记的制作方法
醋酸格拉默分子量标记引言本发明的方面涉及不具有预定氨基酸序列的多肽，其用作醋酸格拉默的分子量标记，并且用于精确测定醋酸格拉默的平均分子量。醋酸格拉默(以前称为共聚物-1)化学上称为L-谷氨酸与L-丙氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸的聚合物的醋酸盐。其具有式(I)的结构式。(Glu, Ala, Lys, Tyr) x. XCH3COOH(C5H9NO4. C3H7NO2. C6H14N2O2. C9H11NO3) x. XC2H4O2式⑴醋酸格拉默是多肽的合成混合物的乙酸盐，所述多肽的每一种基本由四种天然氨基酸组成平均摩尔份数分别为0. 141,0. 427,0. 095和0. 338的L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和L-赖氨酸。醋酸格拉默的平均分子量为5，000-9，000道尔顿。醋酸格拉默在美国以 Copaxone (Teva Pharmaceutical Industries Ltd.的注册商标)销售。指出醋酸
格拉默用于降低患有复发-缓解型多发性硬化症(RRMS)的患者的复发频率。第6，514，938号美国专利公开了七种具有在该专利中鉴定的氨基酸序列的多肽。第7，074，580号美国专利公开了用于获得含有多肽混合物的药品的方法。每种多肽基本由丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成。混合物具有4000道尔顿至13，000道尔顿的平均分子量，并且在该混合物中，丙氨酸的摩尔份数为0. 427，谷氨酸的摩尔份数为0. 141，赖氨酸的摩尔份数为0. 337，并且酪氨酸的摩尔份数为0. 093。该专利教导了测定某一批次的多肽水性混合物的分子量分布，所述多肽的每一种基本由丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成。分子量分布测定使用凝胶渗透色谱柱以测定混合物是否具有用于包含在药品中的4000道尔顿至13，000道尔顿的平均分子量。测定方法包括使用凝胶渗透色谱柱通过使多种分子量标记在柱上进行层析来建立在柱上的保留时间与分子量之间的关系，从而校准所获得的分子量，其中所述分子量标记的每一种为基本由丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成的多肽。第7，163，802号美国专利公开了用于获得含多肽混合物的药品的方法，所述多肽的每一种基本由丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成。多肽混合物具有2000道尔顿至40，000道尔顿的平均分子量，并且在该混合物中，丙氨酸的摩尔份数为0. 38至0. 5，谷氨酸的摩尔份数为0. 13至0. 15，酪氨酸的摩尔份数为0. 08至0. 10，并且赖氨酸的摩尔份数为0.3至0.4。在所述方法中，使用凝胶渗透色谱柱检测某一批次的多肽混合物(所述多肽的每一种基本由丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成)以测定混合物是否具有用于包含在药品中的2000道尔顿至40，000道尔顿的平均分子量。检测方法包括通过使多种分子量标记(所述分子量标记各自为基本由丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成并且具有预定氨基酸序列的多肽)在柱上进行层析来建立在柱上的保留时间与分子量之间的关系，从而校准凝胶渗透色谱柱，所述关系用于测定多肽混合物的平均分子量。仍亟需提供用作用于测定醋酸格拉默多肽组合物的峰值平均分子量(peakaverage molecular weight)的标准的醋酸格拉默分子量标记。
发明概述本发明提供了不具有预定氨基酸序列的多肽，其用作醋酸格拉默的分子量标记，所述分子量标记用作用于测定醋酸格拉默多肽的峰值平均分子量的标准。附图简述
图1为使用基于保留时间(RT)的算法，本发明的分子量标记的RT对那些标记的对数分子量(log molecular weight)的图。图2是根据实施例1制备的分子量标记I的MALDI谱的图示。图3是根据实施例1制备的分子量标记2的MALDI谱的图示。图4是根据实施例1制备的分子量标记3的MALDI谱的图示。图5是根据实施例1制备的分子量标记4的MALDI谱的图不。图6是Copaxone 的圆二色谱的图示。图7是根据实施例1制备的分子量标记2的圆二色谱的图示。图8是根据实施例1制备的分子量标记3的圆二色谱的图示。图9是根据实施例1制备的分子量标记4的圆二色谱的图示。发明详述本发明提供了不具有预定氨基酸序列的多肽，其用作醋酸格拉默的分子量标记，所述分子量标记用作用于测定醋酸格拉默多肽的峰值平均分子量的标准。本发明提供了用作用于测定醋酸格拉默多肽的峰值平均分子量的醋酸格拉默分子量标记的多肽。一方面，本发明提供了具有与醋酸格拉默多肽对应的氨基酸组成且经鉴定的分子量(identified molecular weight)为约2，000道尔顿至约40，000道尔顿或约2，000道尔顿至约20，000道尔顿或约2，000道尔顿至约15，000道尔顿或约2，000道尔顿至约10，000道尔顿的多肽，其用作用于测定多肽的平均分子量的分子量标记。—方面，本发明提供了具有与醋酸格拉默对应的氨基酸组成且经鉴定的分子量为约2，000道尔顿至约40，000道尔顿或约2，000道尔顿至约20，000道尔顿或约2，000道尔顿至约15，000道尔顿或约2，000道尔顿至约10，000道尔顿的多肽，其用作用于测定醋酸格拉默的平均分子量的分子量标记。一方面，本发明提供基本由以下氨基酸组成的多肽丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸，所述氨基酸的摩尔份数为约0. 38至约0. 50的丙氨酸、约0. 13至约0. 155的谷氨酸、约0. 08至约0. 12的酪氨酸和约0. 28至约0. 4的赖氨酸,其用作用于测定多肽的平均分子量的分子量标记。一方面，本发明提供基本由以下氨基酸组成的多肽丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸，所述氨基酸的摩尔份数为约0. 38的丙氨酸至约0. 50的丙氨酸、约0. 13的谷氨酸至约0. 155的谷氨酸、约0. 08的酪氨酸至约0. 12的酪氨酸和约0. 28的赖氨酸至约0. 4的赖氨酸组成，其用作用于测定醋酸格拉默的平均分子量的分子量标记。一方面，本发明提供了制备本发明的分子量标记的方法，其包括单独的或以所述顺序进行的下列步骤中的一步或多步(a)将醋酸格拉默多肽在凝胶渗透色谱(GPC)柱中分级；(b)使步骤(a)中收集的流份通过分子量截留膜；以及
(c)通过将从步骤(b)收集的流份冻干来分离所述分子量标记。一方面，本发明提供了制备本发明的分子量标记的方法，其包括单独的或以所述顺序进行的下列步骤中的一步或多步(a)将醋酸格拉默在凝胶渗透色谱(GPC)柱中分级；(b)使步骤(a)中收集的流份通过分子量截留膜；以及(C)通过将从步骤(b)收集的流份冻干来分离所述分子量标记。步骤(a)包括在凝胶渗透色谱(GPC)柱中分级醋酸格拉默样品。可以在步骤(a)中使用的用于凝胶过滤的合适的色谱介质包括但不限于Superdex 、Sephacryl 、Superose 和Sephadex 等。Superdex 是基于已与葡聚糖共价结合的高度交联的多孔琼脂糖颗粒的复合介质。Superdex 是GEHealthcare公司的商标。Sephacryl 是与N，N，-亚甲基双丙烯酰胺交联的烯丙基葡聚糖。Sephacryl 是GE Healthcare的商标。Superose 是基于高度交联的多孔琼脂糖颗粒的具有高度物理和化学稳定性的介质。Superose 是GEHealthcare Ltd (General Electric的一个公司)的商标。Sephadex 是与表氯醇交联的葡聚糖。Sephadex 是GE Healthcare公司的商标。可以通过溶解于合适的溶剂，然后将所得溶液通过注射器式过滤器(springefilter)过滤以除去任何不期望的颗粒状物质，从而制备醋酸格拉默的样品。可用于制备醋酸格拉默的样品的合适的溶剂包括但不限于Milli Qk水等。Mili1-Q也是MilliporeCorporation, Billerica, MA 的注册商标。可用于步骤(a)的合适的缓冲液包括但不限于乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和氯化钠或者它们的混合物。步骤(b)包括使步骤(a)中收集的流份通过分子截留膜以获得具有窄分子量分布的标记。可用于步骤(b)的合适的分子截留膜可为IKDa至IOKDa或IKDa至20KDa或IKDa至 30KDa。在步骤(b)之前可以进行以下步骤任选地将步骤(a)中收集的各流份冻干，将冻干产物溶解在溶剂中，然后通过分子截留膜。步骤(C)包括通过将从步骤(b)收集的流份冻干来分离分子量标记。可以通过包括现有技术中所述方法的任意方法来测定本发明的标记的分子量。例如，可以通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI)或低角度激光光散射检测(Low AngleLaser Light Scattering Detection, LALLS)或多角度光散射检测(MALLS)来测定本发明的标记的分子量。可以通过包括现有技术中所述方法的任意方法获得用作本发明方法的进料(input)的醋酸格拉默。例如，可以通过在第PCT/US11/34102号国际申请中描述的方法制备醋酸格拉默。—方面，本发明提供了测定多肽或其药学可接受的盐的峰值平均分子量的方法，其包括使所述多肽或其药学可接受的盐在色谱柱上进行层析以测定所述多肽或其药学可接受的盐的平均分子量，其中通过使用多种本发明的分子量标记来校准所述色谱柱，其中每种分子量标记为不具有预定的氨基酸序列的多肽。一方面，本发明提供了测定醋酸格拉默或其药学可接受的盐的峰值平均分子量的方法，其包括使所述格拉默醋酸或其药学可接受的盐在色谱柱上进行层析以测定所述醋酸格拉默或其药学可接受的盐的峰值平均分子量，其中通过使用多种本发明的分子量标记来校准所述色谱柱，其中每种分子量标记为不具有预定的氨基酸序列的多肽。另一方面，本发明提供了通过使用本发明的分子量标记来校准凝胶渗透色谱柱的方法。一方面，本发明提供了用于在分子量分级柱上测定多肽的平均分子量的多种分子量标记。一方面，本发明提供了用于在分子量分级柱上测定醋酸格拉默的平均分子量的多种分子量标记。另一方面，本发明提供了本发明的醋酸格拉默分子量标记的对数分子量与所述分子量标记在分子量分级柱上的保留时间之间的线性关系。为了确认多肽例如共聚物I (用于药品的醋酸格拉默制剂)，必须精确测定在该制剂中的多肽的平均分子量。具有与多肽类似的化学和物理特性的分子量标记提供了用于测定生产批次的分子量的精确且稳定的校准设定。本发明提供了多肽的衍生物，例如用作用于测定多肽例如醋酸格拉默制剂的平均分子量的分子量标记的醋酸格拉默。本发明的分子量标记包括具有与多肽例如醋酸格拉默大致对应的氨基酸组成且经鉴定的分子量为约2，000道尔顿至约40，000道尔顿、约2，000道尔顿至约20，000道尔顿、约2，000道尔顿至约15，000道尔顿或约2，000道尔顿至约10，000道尔顿的多肽，并且用于精确测定多肽例如醋酸格拉默的平均分子量。根据经鉴定的分子量的需求，分子量标记不应为闻度多分散的，并且应具有窄分子量分布。本发明的分子量标记不是定序标记(fixed sequence marker)。一方面，本发明提供了基本由确定摩尔比的以下氨基酸组成的分子量标记丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸。本发明的分子量标记的氨基酸的摩尔比与在多肽例如醋酸格拉默中所发现的相同。这样的摩尔比一致性提供了最好的分子量标记，因为那些标记会具有与多肽例如醋酸格拉默类似的电荷和分子形状。当使用结构不同的标记时，该标记可能以多少不同于多肽例如醋酸格拉默共聚物制剂的方式迁移或洗脱，尽管这些制剂具有与标记物相同的分子量。多种分子量标记是多肽。多种标记可以是两种至约十种或更多种。这些多肽的每一种的经鉴定的峰值平均分子量(identified peak average molecular weight)为约2，000道尔顿至约40，000道尔顿、约2，000道尔顿至约20，000道尔顿、约2，000道尔顿至约15，000道尔顿或约2，000道尔顿至约10，000道尔顿，并且具有与多肽例如醋酸格拉默
大致对应的氨基酸组成。当这样的多种本发明的分子量标记用作用于测定多肽例如醋酸格拉默的平均分子量的标准时，本发明分子量标记在色谱柱上的保留时间与所述标记的分子量对数之间存在近似线性的关系。使用足以在保留时间与分子量之间大致建立线性关系的多种标记。本发明的分子量标记可以具有与醋酸格拉默多肽类似的治疗活性。这些标记可用于使用任意可用的分子量测定操作或设备的任何分子大小辨别系统。例如，本发明的标记可用于校准用于多肽分子量测定的任何色谱操作或设备。这样的色谱设备可以是基于多肽的分子大小而分尚多肽的分子量分级柱。分子量分级柱的实例包括TSK-GEL 柱、Sephadex 柱、Sepharose 柱、Sephacryl 柱和 Superose 柱。定义除非上下文另有所指，对于本发明使用下列定义。Sephacryl 是形成为珠的共价交联的葡聚糖/双丙烯酰胺共聚物凝胶。其在凝胶过滤柱中使用以分离大小为5kD至约150万道尔顿的分子。Sephacryl S-1OO具有IkD至IOOkD的分子量范围并且具有25 y m
至75 li m的粒度。Sephacryl ^ GEHealthcare的注册商标。Superose 12是为生物分子
的高性能凝胶过滤优化的交联的琼脂糖系的介质。其具有约2X IOf^的排阻限，并且是珠直径为8 ii m至12 ii m的交联琼脂糖的复合物。Superose 是GE Healthcare Ltd.的商标。
TSK-GEL 是 Tosoh Corporation 的注册商标。Sepharose 是 GE Healthcare 的注册商标。参考下列实施例会更详细地描述本发明的某些特定方面和实施方案，所述实施例仅为例示目的，而不应解释为以任何方式限制本发明的范围。所述操作的合理变化旨在包含在本发明的范围内。尽管已经例示和描述了本发明的特定方面，但本领域技术人员显而易见的是可以在不背离本发明的精神和范围的情况下进行各种其它变化和修改。因此旨在在所附权利要求中覆盖所有这样的在本发明范围内的变化和修改。
实施例实施例1:醋酸格拉默分子量标记的制备基质:S印hacryItmS-1OOHR(高分辨率)柱床体积:320mL洗脱方式:等度流速:1.8mL/min波长:280nm&215nm流动相:磷酸盐缓冲液(mM)，pH7.2，7.72g 的 NaH2P04、20.45g 的 Na2HPO4 和 35.05g的 NaCl(150mM)/4L 水样品制备:将醋酸格拉默(350mg)溶解在Mill1-Q 水(IOmL)中，并通过0.45 y m注射器式过滤器来过滤。用上述制备的流动相来使柱稳定化。使流动相的流速保持恒定，并且持续稳定化，直至基线达到恒定值。通过泵B装置将样品以相同流速装载到柱上。使用设定标记选项(set mark option)来指示注射标记。记录双波长例如215nm和280nm下的吸光度。在约IllmL的洗脱体积下，在280nm处峰开始上升。将流份收集器激活以递送9mL的各流份。在180mL的洗脱体积下,峰达到其最大值。流动相流仍然继续。在约300mL的洗脱体积下,峰几乎达到其基线。收集约15份流份(每份体积9mL)，停止分级。在收集的流份中，来自上升峰的一份流份、接近峰顶端的两份流份和在拖尾峰的一份流份在SUpeix)SeTM12柱上进行层析，并且记录每份流份的峰值保留时间。在不同的保留时间下洗脱这些流份的每一份。对多个批次重复相同的操作， 并且当它们在分级期间的洗脱时间和洗脱体积恒定时，在Supeix)SeTM-12柱上以相同保留时间洗脱所选的流份。将收集的流份分别冻干以产生每份80mg至90mg。然后分别通过IOKDa分子量截留膜、3KDa分子量截留膜、3KDa分子量截留膜和3KDa分子量截留膜浓缩在约RT23.0分钟、约RT26分钟、约RT29分钟和约RT30分钟的四种所选流份。分别冻干浓缩的溶液以产生15mg、30mg、35mg和12mg的标题化合物。以下给出通过MALDI (基质辅助激光解吸/电离)得出的本发明标记的分子量的确认:
权利要求
1.分子量标记，其具有与醋酸格拉默对应的氨基酸组成和约2，OOO道尔顿至约40，000道尔顿的经鉴定的分子量。
2.如权利要求1所述的分子量标记，其中所述经鉴定的分子量为约2，000道尔顿至约20, 000道尔顿。
3.如权利要求1所述的分子量标记，其中所述经鉴定的分子量为约2，000道尔顿至约15,000道尔顿。
4.如权利要求1所述的分子量标记，其中所述经鉴定的分子量为约2，000道尔顿至约10,000道尔顿。
5.如权利要求1所述的分子量标记，其基本由以下氨基酸组成:丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸，所述氨基酸的摩尔份数为约0.38至约0.50的丙氨酸、约0.13至约0.15的谷氨酸、约0.08至约0.10的酪氨酸和约0.3至约0.4的赖氨酸。
6.如权利要求1所述的分子量标记，其为峰值平均分子量为16833道尔顿的分子量标记1、峰值平均分子量为8908道尔顿的分子量标记2、峰值平均分子量为5006道尔顿的分子量标记3或峰值平均分子量为3709道尔顿的分子量标记4。
7.制备如权利要求1所述的分子量标记的方法，其包括: (a)将醋酸格拉默多肽在凝胶渗透色谱(GPC)柱中分级； (b)使步骤(a)中收集的流份通过分子量截留膜；以及 (C)通过将从步骤(b)收集的流份冻干来分离所述分子量标记。
8.如权利要求7所述的方法，其中步骤(a)的所述凝胶渗透色谱(GPC)柱为Superdex ，其为基于已与葡聚糖共价结合的高度交联的多孔琼脂糖颗粒的复合介质；Sephacryl ,其为与N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺交联的烯丙基葡聚糖；Superose ,其为基于高度交联的多孔琼脂糖颗粒的具有高度物理和化学稳定性的介质；或Sephadex ，其为与表氯醇交联的葡聚糖。
9.如权利要求7所述的方法，其中用于步骤(b)的所述分子量截留膜为IKDa至lOKDa、IKDa 至 20KDa 或 IKDa 至 30KDa。
10.测定醋酸格拉默或其另一种药学可接受的盐的峰值平均分子量的方法，其包括使所述醋酸格拉默或其另一种药学可接受的盐在色谱柱上进行层析以测定所述醋酸格拉默或其药学可接受的盐的平均分子量，其中通过使用多种如权利要求1所述的分子量标记来校准所述色谱柱。
11.通过使用如权利要求1所 述的分子量标记来校准凝胶渗透色谱柱的方法。
全文摘要
本发明的方面涉及用于精确测定醋酸格拉默的平均分子量的醋酸格拉默分子量标记。
文档编号G01N33/68GK103080747SQ201180041836
公开日2013年5月1日 申请日期2011年7月28日 优先权日2010年7月29日
发明者S·斯里尼瓦桑, K·拉玛萨米, C·K·N·哈勒姆, Y·K·K·科马拉沃卢, S·R·卡勒姆, B·H·V·甘吉, R·C·鲍托朱, B·戴维 申请人:雷迪博士实验室有限公司, 雷迪博士实验室公司