专利名称：一种快速鉴定毛发中单乙酰吗啡和吗啡的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速鉴定方法，尤其涉及一种将微粉碎提取技术和液相色谱串联质谱技术应用在分析毛发中单乙酰吗啡及吗啡中的方法。
背景技术：
据《2010世界毒品报告》，我国海洛因摄毒的总人数位居全球首位，是目前严重的社会问题之一。海洛因吸食和注射吸收良好，可大量穿透血脑屏障，迅速产生作用。海洛因进入人体后在血脂酶的作用下迅速代谢成6-单乙酰吗啡，然后进一步在肝脏代谢成吗啡并与葡醛酸结合。海洛因在尿中的代谢产物有6-单乙酰吗啡、游离吗啡、吗啡-3-葡醛酸结合物、吗啡-6-葡醛酸结合物和微量的去甲吗啡(游离或结合)、可待因、二氢吗啡酮等。中国专利CN101813675A披露了一种检测全血、尿中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析方法，其中液相色谱及质谱的条件分别如下:1)色谱条件:流动相由A、B两组份组成，其中A组份为含2mmol/L甲酸铵和0.05% (v/v)甲酸的水，B组份为含2mmol/L甲酸铵和
0.05% (v/v)甲酸的乙腈，A、B两组份的体积比为90: 10 ;柱温为45°C ;流速为0.2mL/min ;进样量为10 ii L。2)质谱条件:检测方式为多反应监测MRM ;扫描方式为正离子扫描；电喷雾电压为3200V;雾化气流速为N2 600 L/hr ;锥孔反吹气流速为N2 50 L/hr ;离子源温度为105°C ;碰撞气为氩气；内标为吗啡-d3。中国专利CN101493415A披露了一种吗啡定量和微量检测方法，利用表面增强拉曼光谱(简称SERS)定量检测吗啡浓度的方法。制备SERS活性基底，取AgNO3溶于水中，配制成AgNO3水溶液，热到78°C 92°C后，加入柠檬酸三钠，同时搅拌60分钟，得到绿黄色的银胶；将银胶高速离心后得到高浓度银胶；把吗啡水溶液与部分高浓度银胶混合进行拉曼光谱测试，得到吗啡-银胶SERS谱图；取剩余高浓度银胶本底进行拉曼光谱测试，得到银胶本底SERS谱图。将两谱图用计算机进行光谱峰值的基线校正，得到高质量的吗啡SERS谱图；与标准的吗啡拉曼光谱强度-浓度曲线对照，得出吗啡的浓度。在涉及海洛因滥用的认定时，常因海洛因特征代谢物单乙酰吗啡在体内代谢快，吸毒12小时后尿液中不能同时检出单乙酰吗啡和吗啡而无法提供有价值的信息。尿液的吗啡阳性可源于海洛因的代谢，也可源于使用含有阿片类生物碱的药物或者食品。因此，解决这一难题的唯一途径是通过毛发分析，检测毛发中的单乙酰吗啡和吗啡，提供海洛因滥用的证据。毛发分析以其易获取、易保存、目标物稳定、检测时限长、能反映较长时间(几个月甚至几年)的药物使用情况等独特优势而在法医毒物学、临床毒物学以及兴奋剂检测领域具有广泛的应用前景。单乙酰吗啡、吗啡固化在毛发的变性角蛋白中，须先使其呈游离态再提取。目前对于毛发中单乙酰吗啡及吗啡的提取方法主要有酸水解过夜、溶剂浸提法、超声提取法、冷冻研磨法等。近年来，由于对嫌疑犯拘留不得超过24小时，因而对吸毒人员的鉴定要求快速、准确。
采用酸水解和溶剂浸提法均需过夜、耗时长，不能满足快速检测的需要。而海洛因及其代谢物单乙酰吗啡不稳定，遇热或长时间放置等容易分解，因而现行采用的甲醇超声等毛发前处理方法，可能致部分单乙酰吗啡分解为吗啡，从而影响了毛发中目标化合物定性结果的可靠性和定量结果的准确性。冷冻研磨技术是近年来新开发的毛发前处理技术，可使毛发在处理过程中始终处于_196°C下，同时毛发的粉碎处理增加了与溶剂的接触面积，有效提高毛发中药物释放效率。但冷冻研磨技术耗时也比较长，通常需要3小时，且冷冻时需要用到大量液氮，成本高。
发明内容
本发明为了解决现有鉴定单乙酰吗啡和吗啡方法中存在的问题，提供一种基于微粉碎提取和液相色谱串联质谱技术的快速分析毛发中单乙酰吗啡以及吗啡的方法。该方法可简便、快速地从复杂生物基质中分离纯化单乙酰吗啡和吗啡分子，满足法医毒物分析领域海洛因吸毒者相关案件的鉴定和侦破的需要。为了实现上述目的提供一种快速鉴定毛发中单乙酰吗啡和吗啡的方法，包括以下顺序步骤:步骤1:将待检测毛发和萃取液、内标吗啡-d3、撞珠一同置于粉碎仪器内进行微粉碎处理。步骤2:将微粉碎处理后得到的混合物进行离心分离。步骤3:取离心分离后混合物的上层清液，对上层清液进行液相色谱-串联质谱分析。在上述提供的方法中，其中所述的方法还包括对毛发鉴定前的脱污染处理，所述脱污染处理包括对毛发依次用二氯甲烷、水和二氯甲烷浸洗。毛发在各浸洗液中浸洗时间一般各为I 5min。在上述提供的方法中，其中所述的方法还包括对毛发鉴定前的脱污染处理，所述脱污染处理包括对毛发依次用十二烷基磺酸钠、洗洁精、水和丙酮洗涤。毛发的洗涤时间为I 5 min。在上述提供的方法中，其中所述的方法还包括对毛发鉴定前的脱污染处理，所述脱污染处理包括在毛发中加入正己烷和丙酮进行超声波处理。毛发超声波处理时间为15 60s。在上述提供的方法中，其中所述的微粉碎处理的时间控制在2 5min之间，振摇频率为 3000 8000 转 /min。在上述提供的方法中，其中所述的萃取液是由乙腈和乙酸铵/甲酸水溶液以70:30的体积比所组成的混合物，所述乙酸铵/甲酸水溶液由20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸所组成。在上述提供的方法中，其中所述的液相色谱-串联质谱分析的条件如下:
I)液相色谱条件:流动相由A、B组成，其中A为含20mmol/L乙酸铵和0.1% (v/v)甲酸的缓冲溶液，B为的乙腈，所述A、B的体积比在0 2min之间为20:80，在2 2.5min之间为 85:15，在 2.5 IOmin 之间为 20:80 ;流速:250u L/min ;进样量:5u L02)质谱条件:
检测方式:多反应监测模式/MRM ;扫描方式:正离子扫描模式/ESI+ ;离子喷雾电压:
5.5 kV ;碰撞气氮气:7 psi ;气帘气:10 psi ;雾化气:20 psi ;辅助气:40 psi ;离子源温度:4500C ;内标:吗啡-d3。
本发明提供鉴定毛发中单乙酰吗啡和吗啡的方法能实现简便、快速地从复杂生物基质中分离纯化单乙酰吗啡和吗啡分子，其特异性、选择性强，灵敏度高，可应用于实际吸毒人员毛发样品的检测，应用于法医毒物分析领域海洛因吸毒者相关案件的鉴定和侦破。
图1是微粉碎处理前毛发的扫描电子显微镜图。图2是微粉碎处理前单根毛发的扫描电子显微镜图。图3是微粉碎处理后毛发的扫描电子显微镜图。图4是微粉碎处理后单根毛发的扫描电子显微镜图。图5是微粉碎处理后毛发结构的扫描电子显微镜图。
具体实施例方式本发明提供一种快速鉴定毛发中单乙酰吗啡和吗啡的方法，先将待检测毛发和萃取液、内标吗啡-d3、撞珠一同置于粉碎仪器内进行微粉碎处理；将微粉碎处理后得到的混合物进行离心分离；取离心分离后混合物的上层清液，对上层清液进行液相色谱-串联质谱分析。以下通过实施例对本发明提供的快速鉴定毛发中单乙酰吗啡和吗啡的方法做进一步说明，以便更好理解本发明创造的内容，但实施例的内容并不限制本发明创造要求保护的范围。样品预处理
对于海洛因滥用者毛发处理前须经洗涤剂和有机溶剂脱污染，有机溶剂通常包括丙酮、甲醇、二氯甲烷、正己烷等。仅使用水和甲醇不能有效除去外部污染。对毛发的预处理可以选用下面提供的一种或多种方法:(1)将毛发样品依次用5mL 二氯甲烷、5mL水、5mL 二氯甲烷各浸洗I 5min。(2)将取毛发样品依次用IOmL 0.1%十二烷基磺酸钠(SDS)、IOmL
0.1%洗洁精、IOmL水、IOmL丙酮振荡洗涤f5min。(3)将毛发样品分别用ImL正己烷、丙酮超声波处理15 60s。预处理过的毛发，在自然晾干后剪成约广2_长的小段，待鉴定使用。将粉碎前的毛发样品喷金后，进行扫描电镜，并记录下扫描电子显微镜图。单乙酰吗啡及吗啡的提取
单乙酰吗啡和吗啡固化在毛发的变性角蛋白中，须先使其呈游离态再提取。本发明采取微粉碎提取法提取毛发中的衡量单乙酰吗啡和吗啡。取剪碎的毛发样品，准确称取50mg，置于聚丙烯酰胺塑料管中，加入萃取液(萃取液是由乙腈和乙酸铵/甲酸水溶液以70:30的体积比所组成的混合物，其中乙酸铵/甲酸水溶液是由20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸所组成)0.6mL，内标吗啡_d3 50ng,再加入
0.5 Ig的玻璃撞珠，将塑料管密封好，置于全自动细胞粉碎仪中微粉碎。粉碎仪设定的振摇时间在2 5min，振摇频率为3000 8000转/min。微粉碎结束后，冷却，离心，取上清液200 u L直接进样。微粉碎后毛发结构被破坏，毛发中的单乙酰吗啡和吗啡释放出。将粉碎后的毛发样品喷金后，进行扫描电镜，并记录下扫描电子显微镜图。液相色谱-串联质谱分析液相色谱条件
色谱柱:Resteck Allure PFP 丙基柱(100mmX2.lmm, 5 u m),前接Phenomenex 保护柱(4mmX2mm)o流动相由20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲溶液(A)与乙腈(B)所组成,流动相A和B组分的体积比在(T2min之间为20:80，在2 2.5min之间为85:15，在2.5 IOmin之间为20:80。流速为250 y L/min，进样量为5 u L0串联质谱条件
电喷雾离子源(ESI )，正离子扫描模式/ESI+，采用多反应监测模式/MRM检测。离子喷雾电压(IS):5.5 kV ;碰撞气氮气(CAD):7 psi (I psi ^ 6.9 kPa)，气帘气(CUR): 10 psi ；雾化气(GSl):20 psi，辅助气(GS2):40 psi ;离子源温度(TEM):4500C0各化合物的质谱参数见表1，选用两对母离子/子离子对进行定性分析，其中第一对离子对用于定量分析。表I液相色谱-串联质谱参数
权利要求
1.一种快速鉴定毛发中单乙酰吗啡和吗啡的方法，其特征在于，包括以下顺序步骤: 步骤1:将待检测毛发和萃取液、内标吗啡-d3、撞珠一同置于粉碎仪器内进行微粉碎处理； 步骤2:将微粉碎处理后得到的混合物进行离心分离； 步骤3:取离心分离后混合物的上层清液，对上层清液进行液相色谱-串联质谱分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对毛发鉴定前的脱污染处理，所述脱污染处理包括对毛发依次用二氯甲烷、水和二氯甲烷浸洗。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述毛发在各浸洗液中浸洗时间各为I 5min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对毛发鉴定前的脱污染处理，所述脱污染处理包括对毛发依次用十二烷基磺酸钠、洗洁精、水和丙酮洗涤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述毛发的洗涤时间为f5 min0
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对毛发鉴定前的脱污染处理，所述脱污染处理包括在毛发中加入正己烷和丙酮进行超声波处理。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述毛发超声波处理时间为15飞Os。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微粉碎处理的时间控制在2 5min之间。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微粉碎处理的振摇频率为30001000转 /min0
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取液为乙腈和乙酸铵/甲酸水溶液以70:30的体积比所组成的混合物，所述乙酸铵/甲酸水溶液由20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸所组成。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱分析的条件如下: 1)液相色谱条件:流动相由A、B组成，其中A为含20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸的缓冲溶液，B为乙腈，所述A、B的体积比在0 2min之间为20:80，在2 2.5min之间为85:15,在2.5 IOmin之间为20:80 ； 流速:250u L/min ； 进样量:5iiL ; 2)质谱条件: 检测方式:多反应监测模式/MRM ； 扫描方式:正离子扫描模式/ESI+ ； 尚子喷雾电压:5.5 kV ； 碰撞气氮气:7 psi ； 气帘气:10 psi ;雾化气:20 psi ； 辅助气:40 psi ； 离子源温度:450°C ； 内标:吗啡-d3。
全文摘要
本发明提供一种快速鉴定毛发中单乙酰吗啡和吗啡的方法，包括以下顺序步骤步骤1将待检测毛发和萃取液、内标吗啡-d3、撞珠一同置于粉碎仪器内进行微粉碎处理；步骤2将微粉碎处理后得到的混合物进行离心分离；步骤3取离心分离后混合物的上层清液，对上层清液进行液相色谱-串联质谱分析。本发明提供鉴定毛发中单乙酰吗啡和吗啡的方法能实现简便、快速地从复杂生物基质中分离纯化单乙酰吗啡和吗啡分子，其特异性、选择性强，灵敏度高，可应用于实际吸毒人员毛发样品的检测，应用于法医毒物分析领域海洛因吸毒者相关案件的鉴定和侦破。
文档编号G01N30/02GK103207242SQ201210007109
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者沈敏, 施妍, 向平, 沈保华, 孙英英 申请人:司法部司法鉴定科学技术研究所