专利名称：九味竺黄制剂的检测方法
技术领域：
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种中药制剂的检测方法。
背景技术：
九味竺黄散为藏药，收载于《卫生部药品标准》藏药分册中，标准编号为 WS3-BC-0248-95，由天竺黄、红花、人工牛黄、力嘎都、榜嘎、甘草、丛菔、兔耳草、檀香九味药组成。主要用于小儿流感，肺炎，上呼吸道感染。天竺黄收载于中华人民共和国药典2010年版一部53页。本品为禾本科植物青皮竹 Bambusa textilis McClure 或华思劳竹 Schizostachyum chinense Rendle 等杆内的分泌液干燥后的块状物。秋、冬二季采收。红花收载于中华人民共和国药典2010年版一部141页。本品为菊科植物红花 Carthamus tinctorius L.的干燥花。夏季花由黄变红时采摘，阴干或晒干。人工牛黄收载于中华人民共和国药典2010年版一部5页。本品由牛胆粉、胆酸、 猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工而成。力嘎都为虎耳草科植物岩白菜属植物岩白菜Bergenia purpurascens (Hook, f. et Thoms. ) Engl. var. delavayi (Franch. ) Engl, et Irm.,以根状莖或全草入药。夏秋米集，挖大留小，洗去泥沙，除去靠近根头的枯朽叶片，晒干即得。榜嘎收载于中华人民共和国药典2010年版一部附录。为毛茛植物船盔乌头 Aconitum naviculare (BruhI.) Stapf 或甘青乌头 Aconitum tanguticum (Maxim.) Stapf 的带根全草。7-9月开花果期采挖带根全草，洗净，切段，晒干或晾干。甘草收载于中华人民共和国药典2010年版一部80页。本品为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch 、胀果甘草 Glycyrrhiza inf lata Bat.或光果甘草 Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根莖。春、秋二季采挖，除去须根，晒干。索罗素扎收载于藏药部颁第一册，标准编号WS3-BC-0029_95,本品为十字花科植物宽果丛菔Solms-Laubachia eurycarpa (Maxim. ) Bofsch的干燥根或全草。花盛期采收, 洗净晾干。洪连收载于中华人民共和国药典2010年版一部249页。本品系藏族习用药材。 为玄参科植物短筒兔耳草Lagotis brevituba Maxim的干燥全草。夏、秋二季花开时采收, 除去杂质,洗净,阴干。檀香收载于中华人民共和国药典2010年版一部357页。本品为檀香科植物檀香 Santalum album L.树干的心材。从菔收载于藏药部颁第一册29页，标准编号WS3-BC-0029-95，本品为十字花科植物宽果丛菔Solms-Laubachia eurycarpa (Maxim. ) Bofsch的干燥根或全草。花盛期采收, 洗净晾干。兔耳草收载于藏药部颁第一册63页，标准编号WS3-BC-0063_95,本品为玄参科植物短管兔耳草Lagotis brevituba Maxim.或全缘兔耳草L. integra ff. Smith.的干燥全草。夏秋花盛期采收。除去杂质，洗净，阴干。目前尚未有九味竺黄制剂的检测方法，也没有对方中的毒性成分进行含量检测的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种九味竺黄制剂的检测方法，所述方法重现性好、专属性强，能够有效地检测九味竺黄制剂的质量，从而使九味竺黄制剂的质量稳定、安全、可控。针对上述目的，本发明的技术方案如下本发明提供一种九味竺黄制剂的检测方法，所述方法包括下述鉴别和/或检查和 /或测定方法的一种或几种通过显微镜鉴别制剂中药材红花和甘草的形态特征；通过薄层层析对制剂中的红花、甘草、人工牛黄进行定性鉴别，以及检查制中榜嘎所含乌头喊含量；通过高效液相色谱法对制剂中的红花所含羟基红花黄色素A的含量进行测定。进一步地，所述显微镜鉴别包括取所述九味竺黄制剂置显微镜下观察，鉴别以下各味药材的形态特征，其中甘草的主要形态特征纤维成束，或纤维周围薄壁细胞中含有草酸钙方晶形成纤维，结晶方形或棱形；红花的主要形态特征花粉粒圆球形或椭圆形，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔 1-5个，分泌细胞单列纵向连接而成分泌管，细胞内充满红棕色物；红花的定性鉴别包括Ia)制备红花的供试品溶液、红花对照药材溶液、不含红花的阴性样品溶液；2a)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤Ia)所获得的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶H薄层板上；3a)以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇为展开剂，将步骤2a)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置日光下检视；供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；甘草的定性鉴别包括Ib)制备甘草的供试品溶液、甘草对照药材溶液、不含甘草的阴性样品溶液；2b照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤Ib)所获得的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶G薄层板上；3b)以石油醚-苯-乙酸乙酯-冰乙酸为展开剂，将步骤2b)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；人工牛黄的定性鉴别包括Ic)制备人工牛黄的供试品溶液、胆酸对照品溶液、不含人工牛黄的阴性样品溶液；2c)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤Ic)所获得的供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶G薄层板上；
3c)以三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，将步骤2c)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与胆酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；榜嘎所含乌头碱含量检查包括Id)制备榜卩戛供试品溶液、乌头喊对照品溶液；2d)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VI B试验，分别吸取步骤Id)所获得的榜嘎供试品溶液、乌头碱对照品溶液，并点样于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上；3d)以甲苯一乙酸乙酯一二乙胺为展开剂，将步骤2d)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点； 红花所含羟基红花黄色素A含量测定包括Ie)制备红花的供试品溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液、不含红花的阴性样品溶液；2e)照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，分别吸取步骤Ie) 所获得的红花供试品溶液和羟基红花黄色素A对照品溶液，注入液相色谱仪，测定；3e)以制剂每I重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0. 0006重量份。更进一步地，所述红花、甘草、人工牛黄、乌头碱以及红花的供试品溶液、对照药材 /对照品溶液、阴性样品溶液的制备方法包括(I)红花的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液取所述九味竺黄制剂，加丙酮，振摇处理，静置，吸取上清液，作为红花的供试品溶液；另取红花对照药材，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；(2)甘草的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液取所述九味竺黄制剂，加硫酸、三氯甲烷，加热回流，滤过，滤液移至分液漏斗中， 分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇使溶解，作为甘草的供试品溶液；另取甘草对照药材，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；(3)人工牛黄的供试品溶液、胆酸对照品溶液、阴性样品溶液取所述九味竺黄制剂，加丙酮，超声处理，滤过，浓缩滤液，作为人工牛黄供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；(4)榜嘎供试品溶液、乌头碱对照品溶液取所述九味竺黄制剂，置具塞锥形瓶中，加氨试液、乙醚，密塞，摇匀，放置，滤过， 药渣加乙醚，振摇，滤过，药渣再用乙醚洗涤，滤过，合并上述滤液与洗液，蒸干，残渣加三氯甲烷使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用 0. 05mol/L硫酸溶液提取，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇使溶解，作为榜嘎供试品溶液；另取乌头碱对照品，加无水乙醇制成乌头喊对照品溶液；(5)红花的供试品溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液、阴性样品溶液取所述九味竺黄制剂，称定，加甲醇，称定重量，超声处理，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为红花的供试品溶液；另取羟基红花黄色素A对照品，称定，加甲醇制成羟基红花黄色素对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液。更进一步地，所述的检测方法包括下述步骤a)红花的定性鉴别取所述九味竺黄制剂1-20重量份，加80%丙酮溶液10-40体积份，密塞，振摇 5-20分钟，静置，吸取上清液，作为红花供试品溶液；另取红花对照药材0. 1-10重量份， 加80%丙酮溶液1-10体积份，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0. 001-0. 02 体积份，分别点于同一娃胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(I 15 : 0. 5 10 0.5 10 0.01 I)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和0-40分钟，展开，取出，晾干， 置日光下检视，供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；b)甘草的定性鉴别取所述九味竺黄制剂0. 5-10重量份，置平底烧瓶中，加2. 5mol/L的硫酸溶液 0. 5-20体积份，再加三氯甲烷10-40体积份，加热回流0. 5-2小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇 0. 5-5体积份使溶解，作为甘草供试品溶液；另取甘草对照药材0. 1-2重量份，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB 试验，吸取上述三种溶液各0. 001-0. 02体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚 (60 90°C)_苯-乙酸乙酯-冰乙酸(5 30 5 30 2 10 : 0. I I)为展开剂， 薄层板置展开缸中饱和0-40分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；c)人工牛黄的定性鉴别取所述九味竺黄制剂0. 5-10重量份，加丙酮10-30体积份，超声处理10_60分钟， 滤过，滤液浓缩至约0. 5-5体积份，作为人工牛黄的供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每I体积份含0. 0001-0. 005重量份的溶液，作为胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，分别吸取上述供试品溶液、对照品溶液各0. 001-0. 02体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(I 10 : I 10 : 0. I I)为展开剂,薄层板置展开缸中饱和0 40分钟, 展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与胆酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。d)榜嘎所含乌头碱的限量检查取所述九味竺黄制剂0. 5-10重量份，置具塞锥形瓶中，加氨试液0. 5-10体积份，再加乙醚10-50体积份，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚25-100体积份，时时振摇 0. 5-2小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤1-5次，每次5-30体积份，滤过，合并上述滤液与洗液， 蒸干，残渣加三氯甲烷5-20体积份使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷5-20体积份分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0. 05mol/L硫酸溶液提取1-10次(10 40体积份， 5 20体积份，5 20体积份，5 20体积份)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次(10 40体积份、5 30体积份、5 30体积份)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇0. 5-2体积份使溶解，作为榜嘎供试品溶液；另外精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每I体积份含0. 0001-0. 005体积份的溶液，作为乌头碱对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含榜嘎的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含榜嘎阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各0. 001-0. 02体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的娃胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(5 30 : 2 10 : 0. I 2)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和0 40分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点；e)红花所含羟基红花黄色素A的含量测定取所述九味竺黄制剂0. 5-10重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25% 甲醇20-100体积份，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz) 10-100分钟，放冷， 再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为红花供试品溶液; 取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每I体积份含羟基红花黄色素 A0. 0001-0. 001重量份的溶液，作为对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成红花阴性样品溶液；照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为10 50 I 5 50 150的甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液为流动相；在(403±2)nm检测波长、柱温为25- 40°C下测定，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000 ;分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0. 005 0. 02体积份，注入液相色谱仪，测定，制剂每I 重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0. 0006重量份。又进一步地，所述的检测方法包括下述步骤a)红花的定性鉴别取所述九味竺黄制剂5重量份，加80%丙酮溶液20体积份，密塞，振摇15分钟， 静置，吸取上清液，作为红花供试品溶液；另取红花对照药材0. 5重量份，加80%丙酮溶液5 体积份，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品， 并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》 2010年版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0. 005体积份，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7 2 3 0.4)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置日光下检视，供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；b)甘草的定性鉴别取所述九味竺黄制剂5重量份，置平底烧瓶中，加2. 5mol/L的硫酸溶液10体积份，再加三氯甲烷30体积份，加热回流I小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇2体积份使溶解,作为甘草供试品溶液；另取甘草对照药材0. 5重量份，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0. 01体积份,分别点于同一娃胶G薄层板上，以石油醚(60 90°C )_苯-乙酸乙酯-冰乙酸(10 20 7 0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；c)人工牛黄的定性鉴别取所述九味竺黄制剂5重量份，加丙酮20体积份，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约2体积份，作为人工牛黄供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每I体积份含 0. 005重量份的溶液，作为胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，分别吸取所述供试品溶液、阴性溶液各0. 005 体积份、对照品溶液为0. 002体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(5 : 5 : 0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。d)榜嘎所含乌头碱的限量检查取所述九味竺黄制剂5重量份，置具塞锥形瓶中，加氨试液3体积份，再加乙醚25 体积份，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚50体积份，时时振摇I小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤3次，每次15体积份，滤过，合并上述滤液与洗液，在60°C的水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷10体积份使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷10体积份分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0. 05mol/L硫酸溶液提取4次(20体积份、10体积份、10体积份、10体积份)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次(20体积份、15体积份、 15体积份)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇I体积份使溶解，作为榜嘎供试品溶液；精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每I体积份含0. 001重量份的溶液，作为乌头碱对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含榜嘎的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含榜嘎阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录 VIB试验，精密吸取所述供试品溶液0. 01体积份，对照品溶液0. 005体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(14 4 I) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，薄层板置展开缸中饱和20分钟，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点；e)红花所含羟基红花黄色素A的含量测定取所述九味竺黄制剂4重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50 体积份，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz) 40分钟，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为红花的供试品溶液；另取羟基红花黄色素A 对照品适量，精密称定，加甲醇制成每I体积份含羟基红花黄色素A0. 00015重量份的溶液， 作为对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成红花阴性样品溶液；照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为26 2 72的甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液为流动相；在403nm检测波长、柱温为30°C下测定，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000 ;分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0. 01体积份，注入液相色谱仪，测定，制剂每I重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0. 0006重量份。上述九味竺黄制剂的原料药组成为天竺黄20重量份、红花15重量份、人工牛黄 5重量份、力嘎都50重量份、榜嘎15重量份、甘草10重量份、索罗素扎/丛菔15重量份、洪连/兔耳草15重量份、檀香7. 5重量份。上述九味竺黄制剂的剂型为散剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂或丸剂。上述述九味药材，除人工牛黄另研细粉外，其余共研成细粉，过筛，加入人工牛黄细粉，加入适量辅料混匀，即得；或取所述九味竺黄制剂，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料制成临床上可接受的口服制剂。上述九味竺黄具有用于制备治疗小儿流感，肺炎，上呼吸道感染的药物的用途。本发明的检测方法建立了红花、甘草的显微鉴别方法；红花、甘草、人工牛黄的薄层鉴别方法，专属性强，重现性较好；由于该制剂处方中含榜嘎，而榜嘎药材中含有乌头碱， 为了保证临床用药安全性，本发明对该制剂乌头碱限量的检查方法进行了研究，并确定了限度。另外还增加了处方中红花药材有效成分羟基红花黄色素A的含量测定方法，该检测方法专属性强，且阴性无干扰。所述检测方法经多人多次反复操作，结果准确、重现性好、专属性强，符合准确、简便、灵敏、快速的原则，可以有效的检测产品的质量。
图I为本发明所述的红花和甘草显微鉴别图，其中，1-3分别为晶鞘纤维、花粉粒、 分泌细胞；图2为本发明所述的红花鉴定薄层色谱图，其中，1-3为红花鉴定中的红花供试品，4-5为红花对照药材，6为不含红花的阴性样品；图3为本发明所述的甘草鉴定薄层色谱图，其中，1-3为甘草鉴定中甘草的供试品，4-5为甘草对照药材，6为不含甘草的阴性样品。图4为本发明所述的人工牛黄鉴定薄层色谱图，其中，1-3为人工牛黄供试品，4-5 为胆酸对照品，6为不含人工牛黄的阴性样品。图5为本发明所述的榜嘎所含乌头碱限量薄层色谱图，图中1-3为榜嘎供试品， 4-5为乌头碱对照品，6为不含榜嘎的阴性样品。图6为本发明所述的红花所含羟基红花黄色素A色谱图，其中，A-C分别为羟基红花黄色素A对照品、红花供试品、不含红花的阴性样品。图7为羟基红花黄色素A的峰面积与对照品浓度的线性关系图。
具体实施例方式下述实验例和实施例进一步说明、但不限制本发明。实验例I :红花和甘草的晶微鉴别(I)仪器
显微镜、照相机、载玻片、盖玻片、电子天平、移液管、滤纸、超声仪。(2)试剂水合氯醛、甘油、蒸馏水、醋酸。(4)检验方法透化溶剂水合氯醛试液、醋酸甘油试液、稀甘油等溶液为透化溶剂。透化方法传统加热透化方法和烘箱加热方法。分别选择以上透化溶剂和透化方法进行试验，结果如下
权利要求
1.一种九味竺黄制剂的检测方法，所述方法包括下述鉴别和/或检查和/或测定方法的一种或几种通过显微镜鉴别制剂中药材红花和甘草的形态特征；通过薄层层析对制剂中的红花、甘草、人工牛黄进行定性鉴别，以及检查制剂中榜嘎所含乌头喊含量；通过高效液相色谱法对制剂中红花所含羟基红花黄色素A的含量进行测定。
2.如权利要求I所述的检测方法，其中，所述显微镜鉴别包括取所述九味竺黄制剂，制片，置显微镜下观察，鉴别以下各味药材的形态特征，其中 甘草的主要形态特征纤维成束，或纤维周围薄壁细胞中含有草酸钙方晶形成纤维，结晶方形或棱形；红花的主要形态特征花粉粒圆球形或椭圆形，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔1-5 个，分泌细胞单列纵向连接而成分泌管，细胞内充满红棕色物；红花的定性鉴别包括Ia)制备红花的供试品溶液、红花对照药材溶液、不含红花的阴性样品溶液；2a)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤la)所获得的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶H薄层板上；3a)以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇为展开剂，将步骤2a)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置日光下检视；供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；甘草的定性鉴别包括Ib)制备甘草的供试品溶液、甘草对照药材溶液、不含甘草的阴性样品溶液；2b照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤Ib)所获得的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶G薄层板上；3b)以石油醚-苯-乙酸乙酯-冰乙酸为展开剂，将步骤2b)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；人工牛黄的定性鉴别包括Ic)制备人工牛黄的供试品溶液、胆酸对照品溶液、不含人工牛黄的阴性样品溶液；2c)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤lc)所获得的供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶G薄层板上；3c)以三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，将步骤2c)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与胆酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；榜嘎所含乌头碱含量检查包括Id)制备榜卩戛供试品溶液、乌头喊对照品溶液；2d)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤Id)所获得的榜嘎供试品溶液、乌头碱对照药品溶液，并点样于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上；3d)以甲苯一乙酸乙酯一二乙胺为展开剂，将步骤2d)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点；红花所含羟基红花黄色素A含量测定包括Ie)制备红花的供试品溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液、不含红花的阴性样品溶液；2e)照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，分别吸取步骤le)所获得的供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，测定；3e)以制剂每I重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于O. 0006重量份。
3.如权利要求2所述的检测方法，其中所述红花、甘草、人工牛黄、榜嘎供试品溶液、对照药材溶液/对照品溶液、阴性样品溶液的制备方法包括(1)红花的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液取所述九味竺黄制剂，加丙酮，振摇处理，静置，吸取上清液，作为红花的供试品溶液； 另取红花对照药材，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；(2)甘草的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液取所述九味竺黄制剂，加硫酸、三氯甲烷，加热回流，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺， 配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；(3)人工牛黄的供试品溶液、胆酸对照品溶液、阴性样品溶液取所述九味竺黄制剂，加丙酮，超声处理，滤过，浓缩滤液，作为人工牛黄供试品溶液； 另取胆酸对照品，加丙酮制成胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；(4)榜嘎供试品溶液、乌头碱对照品溶液取所述九味竺黄制剂，置具塞锥形瓶中，加氨试液、乙醚，密塞，摇匀，放置，滤过，药渣加乙醚，振摇，滤过，药渣再用乙醚洗涤，滤过，合并上述滤液与洗液，蒸干，残渣加三氯甲烷使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用O. 05mol/L 硫酸溶液提取，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇使溶解，作为榜嘎供试品溶液；另取乌头碱对照品，加无水乙醇制成对照品溶液；(5)红花的供试品溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液、阴性样品溶液取所述九味竺黄制剂，称定，加甲醇，称定重量，超声处理，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为红花的供试品溶液；另取羟基红花黄色素A对照品，称定，加甲醇制成羟基红花黄色素对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液。
4.如权利要求1-3任一项所述的检测方法，包括下述步骤a)红花的定性鉴别取所述九味竺黄制剂1-20重量份，加80%丙酮溶液10-40体积份，密塞，振摇5-20分钟，静置，吸取上清液，作为红花供试品溶液；另取红花对照药材O. 1-10重量份，加80% 丙酮溶液ι- ο体积份，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各O. 001-0. 02体积份， 分别点于同一娃胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇，体积比I 15 O. 5 10 O. 5 10 O. 01 I为展开剂，薄层板置展开缸中饱和0-40分钟，展开，取出，晾干， 置日光下检视，供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；b)甘草的定性鉴别取所述九味竺黄制剂O. 5-10重量份，置平底烧瓶中，加2. 5mol/L的硫酸溶液O. 5-20 体积份，再加三氯甲烷10-40体积份，加热回流O. 5-2小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇O. 5-5体积份使溶解，作为甘草供试品溶液；另取甘草对照药材O. 1-2重量份，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各O. 001-0. 02体积份,分别点于同一娃胶G薄层板上，以60 90°C石油醚-苯-乙酸乙酯-冰乙酸,体积比5 30 : 5 30 : 2 10 : O. I I为展开剂，薄层板置在展开缸中饱和O 40分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；c)人工牛黄的定性鉴别取所述九味竺黄制剂O. 5-10重量份，加丙酮10-30体积份，超声处理10-60分钟，滤过，滤液浓缩至约O. 5-5体积份，作为人工牛黄的供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每I体积份含O. 0001-0. 005重量份的溶液，作为胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，分别吸取上述供试品溶液、对照品溶液各O. 001-0. 02体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸，体积比I 10 : I 10 : O. I I为展开剂,薄层板置展开缸中饱和O 40分钟，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与胆酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；d)榜嘎所含乌头碱的限量检查取所述九味竺黄制剂O. 5-10重量份，置具塞锥形瓶中，加氨试液O. 5-10体积份，再加乙醚10-50体积份，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚25-100体积份，时时振摇O. 5-2 小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤1-5次，每次5-30体积份，滤过，合并上述滤液与洗液，蒸干， 残渣加三氯甲烷5-20体积份使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷5-20体积份分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用O. 05mol/L硫酸溶液提取1-10次10 40体积份，5 20 体积份，5 20体积份，5 20体积份，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次10 40体积份、5 30体积份、5 30体积份，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇O. 5-2体积份使溶解，作为榜嘎乌头碱供试品溶液；另外精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每I体积份含O. 0001-0. 005体积份的溶液，作为乌头碱对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含榜嘎乌头碱的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含榜嘎乌头碱阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VI B试验，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各O. 001-0. 02体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺，体积比5 30 2 10 O. I 2为展开剂，将薄层板置展开缸中饱和O 40分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点；e)红花所含羟基红花黄色素A的含量测定取所述九味竺黄制剂O. 5-10重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇 20-100体积份，称定重量，功率250W，频率40kHz超声处理10-100分钟，放冷，再称定重量， 用25 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为羟基红花黄色素A红花供试品溶液；取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每I体积份含羟基红花黄色素 A0. 0001-0. 001重量份的溶液，作为对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成红花阴性样品溶液；照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为10 50 I 5 : 50 150的甲醇-乙腈-O. 7%磷酸溶液为流动相；在403±2nm检测波长、 柱温为25 _40°C下测定，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000 ;分别精密吸取对照药材溶液和供试品溶液各O. 005 O. 02体积份，注入液相色谱仪，测定，制剂每I 重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于O. 0006重量份。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，包括下述步骤a)红花的定性鉴别取所述九味竺黄制剂5重量份，加80%丙酮溶液20体积份，密塞，振摇15分钟，静置， 吸取上清液，作为红花的供试品溶液；另取红花对照药材O. 5重量份，加80%丙酮溶液5体积份，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》 2010年版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各O. 005体积份，分别点于同一硅胶H薄层板上，以体积比7 2 3 O. 4的乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置日光下检视，供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；b)甘草的定性鉴别取所述九味竺黄制剂5重量份，置平底烧瓶中，加2. 5mol/L的硫酸溶液10体积份，再加三氯甲烷30体积份，加热回流I小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇2体积份使溶解，作为甘草供试品溶液；另取甘草对照药材O. 5重量份，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各O. 01 体积份，分别点于同一娃胶G薄层板上，以体积比10 : 20 : 7 : O. 5的60 90°C石油醚-苯-乙酸乙酯-冰乙酸为展开剂，薄层板置在展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干， 置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；c)人工牛黄的定性鉴别取所述九味竺黄制剂5重量份，加丙酮20体积份，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约2体积份，作为人工牛黄供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每I体积份含O. 005 重量份的溶液，作为胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，分别吸取所述供试品溶液、阴性溶液各O. 005体积份、 对照品溶液为O. 002体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比5 5 O. 5的三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与胆酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；d)榜嘎所含乌头碱的限量检查取所述九味竺黄制剂5重量份，置具塞锥形瓶中，加氨试液3体积份，再加乙醚25体积份，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚50体积份，时时振摇I小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤3次，每次15体积份，滤过，合并上述滤液与洗液，在60°C的水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷10体积份使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷10体积份分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用O. 05mol/L硫酸溶液提取4次(20体积份、10体积份、10体积份、10体积份)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再分别用20体积份、15体积份、15体积份的三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇I体积份使溶解，作为榜嘎供试品溶液；精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每I体积份含O. 001重量份的溶液， 作为乌头碱对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含榜嘎的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含榜嘎阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，精密吸取所述供试品溶液O. 01体积份，对照品溶液O. 005体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为14 4 I的甲苯-乙酸乙酯-二乙胺为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点；e)红花所含羟基红花黄色素A的含量测定取所述九味竺黄制剂4重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50体积份，称定重量，功率250W，频率40kHz超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为红花的供试品溶液；另取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每I体积份含羟基红花黄色素A0. 00015重量份的溶液，作为羟基红花黄色素A对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成红花阴性样品溶液；照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为26 2 72的甲醇-乙腈-O. 7%磷酸溶液为流动相；在40311111检测波长、柱温为30°C下测定，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000 ;分别精密吸取对照药材溶液和供试品溶液各O. 01体积份， 注入液相色谱仪，测定，制剂每I重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于O. 0006重量份。
6.如权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述九味竺黄制剂的原料药组成为天竺黄20重量份、红花15重量份、人工牛黄5重量份、力嘎都50重量份、榜嘎15重量份、甘草10重量份、索罗素扎/丛菔15重量份、洪连/兔耳草15重量份、檀香7. 5重量份。
7.如权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述九味竺黄制剂的剂型为散剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂或丸剂。
8.如权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述九味竺黄制剂的制备方法为取所述九味药材，除人工牛黄另研细粉外，其余共研成细粉，过筛，加入人工牛黄细粉，加入适量辅料混匀，即得；或取所述九味竺黄制剂，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料制成临床上接受的口服制剂。
9.如权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述九味竺黄制剂具有用于制备治疗小儿流感，肺炎，上呼吸道感染的药物的用途。
全文摘要
本发明涉及九味竺黄制剂的检测方法，包括下述鉴别和/或检测方法的一种或几种通过显微镜鉴别制剂中的药材甘草和红花的形态特征；通过薄层层析对制剂中的红花、甘草、人工牛黄进行定性鉴别；以及检查制剂中棒嘎所含乌头碱含量；通过高效液相色谱法对制剂中红花所含羟基红花黄色素A的含量进行测定。通过上述检测方法，可以对九味竺黄制剂进行有效的检测。
文档编号G01N30/02GK102590212SQ20121001351
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者刘鸿雁, 张国霞, 陈丽娟 申请人:西藏奇正藏药股份有限公司