专利名称：一种蛇伤快速鉴别的方法
技术领域：
本发明属于蛇伤鉴别方法，具体为一种利用包被有蛇毒特异性抗体的酶标条快速鉴别蛇伤的方法。
背景技术：
传统蛇伤类型判断是依靠蛇伤临床症状分析来实现的，由于医者经验不足、临床症状不明显或已扩散至无法判断，就会导致误判，耽误蛇伤治疗。为避免传统蛇伤判定的缺陷，世界范围内已有一些国家开展以蛇毒特异性抗体来制备蛇伤快速诊断产品的研究， 相关诊断产品利用被蛇类咬伤患者的体液能在短时间内准确地判定蛇伤类型，从而保障抗蛇毒血清的准确使用。尽管有研究表明胶体金、乳胶凝集法等方法在技术上都能用于鉴别蛇毒，从而确定蛇伤类型，但鉴于成本高或者操作复杂等原因，至今尚未有产品得以实际应用。酶联免疫分析方法(ELISA)在蛇毒鉴别中运用最为广泛，其中澳大利亚已经生产蛇伤快速诊断试剂盒用于临床检测，为蛇伤的快速判断与治疗作出了积极的贡献。我国是蛇类资源大国，长江以南地区普遍分布有各类毒蛇，在每年的活动旺季，对当地的人类活动造成了严重的危害。但迄今为止，国内对蛇伤类型的判断仍旧依靠其临床症状表现，缺乏快速、 简单、有效的诊断方法用于临床辅助判断蛇伤。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供一种蛇伤快速鉴别的方法，其特征在于按如下步骤进行I.制备抗蛇毒免疫球蛋白(IgG)。选取所需鉴别的6种蛇毒，用20mM PBS溶解后， 离心取上清，并测定蛋白含量。皮下多点注射大鼠，制备6种多克隆抗蛇毒粗血清。粗血清先经过硫酸铵沉淀去除非蛋白组分，再通过Hitrap protein IgG柱纯化,获得6种抗蛇毒 IgG02.筛选蛇毒物种特异性IgG。将蛇毒偶联至活化的CNBr-activated sepharose 4B亲和介质上，等量任取5种蛇毒偶联后的湿润亲和介质共O. 3g混合后装入离心浓缩管内管。室温下，500 μ g的每种蛇毒的抗血清IgG分别与其余种蛇毒偶联的亲和介质在水平摇床温和地混匀2小时。随后离心，用离心浓缩管外管收集未结合组分的洗出液，即为该种蛇毒区别于其它5种蛇毒的物种特异性IgG。3.蛇毒特异性IgG生物素化。特异性抗体和生物素重量比I : 5混合后，室温震荡结合2小时，随后透析去除未结合生物素，得到生物素化特异性IgG。4.检测酶标条制作。以8孔酶标条为载体，配有一个“T”形支架。酶标条上设置 6个样品检测孔，I个阳性和I个阴性对照孔。各孔经2%牛血清封闭，漂洗控干后在-20度保存。5.蛇伤快速鉴别。检测时，采集蛇伤患者伤口部位流出液，滴加至各检测孔，依次经过生物素化特异性抗体、亲和素化HRP的结合后，加入TMB显色，根据检测孔的阳性或者阴性结果准确判断蛇伤类型。上述一种蛇伤快速鉴别方法，具有如下优点I.成本低。各种特异性抗体的筛选、测试条和测试过程辅助试剂的制备成本低，无需昂贵的耗材支撑。2.操作简单。整个检测过程所需组件简单、体积小，无需借助仪器，检测人员无需丰富的临床诊断经验。3.检测时间短。从低温下取出测试条到显色结束，用时40-45分钟，在蛇伤发生现场或患者运送过程中就能完成。4.准确性高。借助抗原抗体特异性结合原理，能有效保证待测样品中蛇毒结合到特异性抗体上。借助生物素-亲和素结合原理，能将最终显色效果的信号较传统的双抗夹心法放大4倍，有效保证阳性检测结果能被肉眼准确识别。本发明已列入杭州市属高校重点实验室科技创新项目(项目合同号 20080433T03)和浙江省科学技术厅重大科技专项项目(项目合同号2009C13045)。
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具体实施例方式实施例I.制备抗蛇毒免疫球蛋白(IgG)。选取所需鉴别的6种蛇毒(眼镜蛇、银环蛇、五步蛇、蝮蛇、竹叶青和烙铁头蛇毒)，用20mM PBS溶解后，离心取上清，并测定蛋白含量。皮下多点注射大鼠，制备6种多克隆抗蛇毒粗血清。粗血清先经过硫酸铵沉淀去除非蛋白组分，再通过Hitrap protein IgG柱纯化,获得6种抗蛇毒IgG。2.筛选蛇毒物种特异性IgG。将蛇毒偶联至活化的CNBr-activated sepharose 4B亲和介质上，等量任取5种蛇毒偶联后的湿润亲和介质共O. 3g混合后装入离心浓缩管内管。室温下，500 μ g的每种蛇毒的抗血清IgG分别与其余种蛇毒偶联的亲和介质在水平摇床温和地混匀2小时。随后离心，用离心浓缩管外管收集未结合组分的洗出液，即为该种蛇毒区别于其它5种蛇毒的物种特异性IgG。3.蛇毒特异性IgG生物素化。特异性抗体和生物素重量比I : 5混合后，室温震荡结合2小时，随后透析去除未结合生物素，得到生物素化特异性IgG。4.检测酶标条制作。以8孔酶标条为载体，配有一个“T”形支架。8个孔依次包被6种蛇毒特异性抗体混合液(I)、包被液(2)、银环蛇毒特异性IgG(3)、眼镜蛇毒特异性 IgG(4)、五步蛇毒特异性IgG(5)、短尾蝮蛇特异性IgG(6)、竹叶青蛇毒特异性抗体(7)和烙铁头蛇毒特异性抗体(8)，每孔的抗体加样量为200ng，在37度结合2小时。各孔经2%牛血清封闭，漂洗控干后在-20度保存。5.蛇伤快速鉴别。检测时，取出测试条，室温静置5分钟。在对照孔1、2中加入6 种蛇毒的混合液，在检测孔3-8中均匀滴入蛇伤患者体液(伤口溢出液、血液或尿液)，室温孵育10分钟。倒去液体，用清水快速漂洗3次后控干。随后在对照孔中加入6种蛇毒的生物素化特异性IgG混合液，在检测孔中分别加入生物素化的银环蛇毒特异性IgG、眼镜蛇毒特异性IgG、五步蛇毒特异性IgG、蝮蛇毒特异性IgG、竹叶青蛇毒特异性IgG和烙铁头蛇毒特异性IgG，室温孵育10分钟。倒去液体，用清水快速漂洗3次后控干。加入亲和素化的HRP，室温孵育10分钟。倒去液体，用清水快速漂洗3次。随后加入TMB显色液，室温显色5-10分钟，判断蛇伤类型。其中，如果仅有孔I显色，则为无毒蛇咬伤(图3);如果孔I、 3同时显色，则为银环蛇咬伤(图4);如果孔1、4同时显色，则为眼镜蛇咬伤(图5);如果孔1、5同时显色，则为五步蛇咬伤(图6);如果孔1、6同时显色，则为短尾蝮咬伤(图7); 如果孔1、7同时显色，则为竹叶青咬伤(图8);如果孔1、8同时显色，则为烙铁头咬伤(图 9);如果各孔均不显色，则检测条失效(见图10)，应更换新测试条后重新测试。
权利要求
1.一种蛇伤快速鉴别的方法，其特征步骤在于按如下步骤进行(1)制备抗蛇毒免疫球蛋白(IgG)。选取所需鉴别的6种蛇毒(眼镜蛇、银环蛇、五步蛇、蝮蛇、竹叶青和烙铁头蛇毒)，皮下多点注射大鼠，制备6种多克隆抗蛇毒粗血清。粗血清先经过硫酸铵沉淀去除非蛋白组分，再通过Hitrap protein IgG柱纯化,获得抗蛇毒 IgG0(2)筛选蛇毒物种特异性IgG。将蛇毒偶联至活化的CNBr-activatedsepharose 4B亲和介质上，等量任取5种蛇毒偶联后的湿润亲和介质共O. 3g混合后装入离心浓缩管内管。 室温下，500 μ g的每种蛇毒的抗血清IgG分别与其余种蛇毒偶联的亲和介质在水平摇床温和地混匀2小时。随后离心，用离心浓缩管外管收集未结合组分的洗出液，即为该种蛇毒区别于其它5种蛇毒的物种特异性IgG。(3)蛇毒特异性IgG生物素化。特异性抗体和生物素重量比I: 5混合后，室温震荡结合2小时，随后透析去除未结合生物素，得到生物素化特异性IgG。(4)检测酶标条制作。以8孔酶标条为载体，配有一个“T”形支架。酶标条上设置6个样品检测孔，I个阳性和I个阴性对照孔。各孔经2%牛血清封闭，漂洗控干后在-20度保存。(5)蛇伤快速鉴别。检测时，采集蛇伤患者伤口部位流出液，滴加至各检测孔，依次经过生物素化特异性抗体、亲和素化HRP的结合后，加入TMB显色，根据检测孔的阳性或者阴性结果准确判断蛇伤类型。
2.根据权利要求I所述一种蛇伤快速鉴别的方法，其特征在于所述步骤(4)中的8孔分别包被6种蛇毒特异性抗体混合液(I)、包被液(2)、银环蛇毒特异性IgG(3)、眼镜蛇毒特异性IgG(4)、五步蛇毒特异性IgG(5)、短尾蝮蛇特异性IgG(6)、竹叶青蛇毒特异性抗体(7) 和烙铁头蛇毒特异性抗体(8)，每孔抗体量为200ng。
3.根据权利要求I所述一种蛇伤快速鉴别的方法，其特征在于所述步骤(4)中在酶标孔中包被6种蛇毒特异性抗体混合液为阳性对照(6)，在酶标孔中加入包被液为阴性对照(5)。
全文摘要
本发明公布了一种用酶标条为载体的蛇伤快速鉴别方法，即以蛇毒物种特异性抗体包被酶标孔，将采集的蛇伤患者血清滴至孔内，能在短时间内判断出蛇伤类型。本方法中各种特异性抗体的筛选、酶标条和测试过程辅助试剂的制备成本低；检测过程简单，无需借助仪器，检测人员无需丰富的临床诊断经验；检测时间短，从低温下取出酶标条到结果显色约40-45分钟；准确性高，AB-双抗夹心法能有效保证蛇毒与特异性抗体结合，生物素-亲和素有效放大信号，肉眼能直接观测显色结果。
文档编号G01N33/543GK102590496SQ20121003275
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者屈彦福, 王金, 计翔, 马小梅, 高建芳 申请人:屈彦福, 王金, 计翔, 马小梅, 高建芳