专利名称：分析芯片、分析系统及分析方法
技术领域：
本发明涉及一种分析芯片、分析系统及分析方法，特别是提供一种可供进行利用竞争反应的定量分析的分析芯片、分析系统及分析方法。
背景技术：
近年来，在医疗、健康、食品及药品开发等领域，检测DNA(Deoxyribonucleic Acid,脱氧核糖核酸)、酶、抗原、抗体、蛋白质、病毒及细胞等生物物质、以及化学物质并进行定量的重要性不断提升。与此相对应，本领域技术人员提出了各种用来简便地测定所述生物物质及化学物质等的生物芯片及微型化学芯片(以下，将这些总称为“分析芯片”)。由于分析芯片被制作成可以在数cm见方且厚度为数mm Icm左右的芯片内简易地进行实验室内所进行的一系列分析操作，所以样品及试剂的使用量为微量便可。这样，分析芯片可以低成本地进行高生产性的检查，所以具有可以在采集样品的现场立即获得检查结果等诸多优点。这种分析芯片适合用于例如血液检查或唾液检查等生物化学检查用途。例如，专利文献I中公开了用来测定水性液体试样中是否存在样品或样品的浓度的电化学试验设备。在专利文献I中，通过使用所述电化学试验设备，能以简便的操作测定像血液等水性液体试样中的葡萄糖浓度等。[背景技术文献][专利文献][专利文献I]日本专利特表2001-518620号公报
发明内容
[发明所要解决的问题]但是，在蛋白质的化学反应系统中，生成低分子量的单纯的分子的情况极少，难以如葡萄糖的化学反应系统般与高氧化还原性的H2O2的生成或O2的消耗相联系。因此，大量的蛋白质如果不通过像酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ELISA)这样的复杂方法，则无法进行分析。其中，在分析皮质醇之类的分子量较小的蛋白质的情况下，必须使用竞争法。但是，因为通过竞争法进行的分析中分析操作复杂，所以更难实现使用分析芯片的简易的分析。因此，必须使用竞争法进行分析的蛋白质的分析通常是使用对孔内实施了特异性处理的微孔来进行。但是，在使用微孔的方法中，因为需要特殊的器具、装置，所以实际上例如难以在采集样品(液体试样)的场所进行流式检测(flow assay)。另外，因其操作也较为复杂，所以还要求操作者必须熟练。由如上所述的情况可知，实际上尚难以利用如使用分析芯片的分析方法的简易方法来进行利用竞争法的分析。因此，本发明的目的在于提供一种能够简便地实现利用竞争法的分析的分析芯片、分析系统及分析方法。
[解决问题的技术手段]本发明的一形态是一种分析芯片，用来分析液体试样中的测定对象物质，且包括基体、及形成在该基体表面的用来使液体试样从上游侧流向下游侧的流路；流路包括导入部，用来将液体试样导入至流路；反应部，设置在该导入部的下游侧，用来使液体试样进行竞争反应；排出部，设置在该反应部的下游侧；及拦阻部，设置在反应部与排出部之间，用来抑制液体试样从反应部流到排出部；且反应部中收纳着预先固定有与测定对象物质特异性地结合的特异性结合物质或测定对象物质的竞争物质的载体。在所述分析芯片中，优选的是拦阻部的流路宽度比反应部的流路宽度窄。另外，在所述分析芯片中，优选的是构成拦阻部的流路具有斥液性。另外，在所述分析芯片中，优选的是导入部的流路宽度比反应部的流路宽度窄。另外，在所述分析芯片中，优选的是排出部中收纳有吸收体，该吸收体用来吸收从反应部流出的液体试样。另外，本发明提供一种分析系统，包括所述分析芯片；及分析装置，用来根据选自由该分析芯片的反应部所产生的荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种响应，来分析测定对象物质。另外，本发明的另一形态是一种分析方法，使用所述分析芯片来分析液体试样中的测定对象物质，且包括如下步骤将含有具有标记部的特异性结合物质或具有标记部的竞争物质、与液体试样的反应液导入至反应部内；在反应部内，使反应液和预先固定在载体上的特异性结合物质或竞争物质进行竞争反应；在竞争反应的步骤之后，使反应液流出到排出部；及在流出的步骤之后，根据选自由来自残留在反应部内的具有标记部的竞争物质或具有标记部的特异性结合物质的荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种响应，来分析测定对象物质。在所述分析方法中，优选的是导入的步骤包含从导入部导入反应液的步骤。另外，在所述分析方法中，优选的是流出的步骤包含使清洗液流入到反应部的步骤。另外，在所述分析方法中，优选的是标记部发出选自由荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种响应。另外，在所述分析方法中，优选的是分析步骤包含使含有与标记部进行酶促反应的基质的基质溶液流入到反应部的步骤，基质是通过与标记部进行酶促反应，而引起选自由荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种响应的物质。本发明的又一形态是一种分析芯片，用来分析液体试样中的测定对象物质，且包括基体；展开层，配置在基体上，可以使液体试样从一端侧展开至另一端侧；及吸收层，配置成与展开层的另一端侧接触；且展开层包含竞争反应区域，该竞争反应区域为位于一端侧与另一端侧之间的区域的至少一部分，且固定有测定对象物质的竞争物质，在竞争反应区域上，还包括用来检测竞争反应区域内的电化学变化的电极部。在所述分析芯片中，优选的是还包括配置在基体上的盖体，且盖体在与配置在基体上的展开层的一端侧相对应的位置上，设置了用来将液体试样导入至一端侧的导入部。在所述分析芯片中，优选的是电极部的一部分从基体与盖体之间露出。在所述分析芯片中，优选的是测定对象物质为皮质醇。
另外，本发明提供一种分析系统，包括所述分析芯片；及测定装置，与所述分析芯片的电极部电性连接，用来测定电极部所检测出的电化学变化。另外，本发明的又一形态是一种分析方法，使用所述分析芯片，来分析液体试样中的测定对象物质，且 包括如下步骤将含有具有标记部的特异性结合物质和液体试样的反应液导入至展开层的一端侧；使反应液展开至展开层的竞争反应区域；在竞争反应区域内，使反应液和竞争物质进行竞争反应；在竞争反应的步骤之后，将含有基质的基质溶液导入至展开层的一端侧；使基质溶液展开至竞争反应区域；在竞争反应区域内，使基质溶液和标记部进行酶促反应；及检测来自酶促反应的电化学变化。在所述分析方法中，优选的是在竞争反应的步骤与导入基质溶液的步骤之间，还包括从展开层的一端侧导入清洗液的步骤，以及使清洗液展开至竞争反应区域的步骤。[发明的效果]根据本发明的分析芯片、分析系统及分析方法，可以简便地进行利用竞争法的分析。
图I是第I实施方式中的分析芯片的示意性平面图。图2是图I的基体的示意性平面图。图3是图I的基体的示意性立体图。图4是用来说明第I实施方式中载体的构成的一例的示意图。图5是表示第I实施方式中的分析方法的流程图。图6的(a) (d)是概略性地表示第I实施方式中的分析方法的各步骤的平面图。图7的(a) (d)是概略性地表示第I实施方式中的分析方法的各步骤的截面图。图8的(a) (C)是用来说明第I实施方式中反应部中的竞争反应的示意图。图9是表示第I实施方式中的分析系统的示意图。图10是表示实施例I中分析得出的皮质醇浓度和荧光强度的关系的图。图11是第2实施方式中的分析芯片的示意性平面图。图12是表示第2实施方式中在基体的表面设置有凹部的状态的示意性立体图。图13是用来说明第2实施方式中固定在竞争反应区域内的竞争物质的示意图。图14是分析芯片的另一形态的示意性平面图。图15是图14的分析芯片的示意性立体图。图16是第2实施方式中的分析系统的示意图。图17是表示第2实施方式中的分析方法的流程图。图18的(a) (C)是用来说明第2实施方式中竞争反应区域内的竞争反应的示意图。图19是表示实施例2中分析得出的皮质醇浓度和电流值的关系的图。[符号的说明]10 基体11 流路12 导入部
13反应部14排出部15拦阻部21载体22吸收体31固定化皮质醇32BSA 33皮质醇34标记化特异性结合物质34a皮质醇抗体34bHRP40反应液41清洗液42基质溶液50测定装置51光出射器52检测器53显示器60分析芯片61基体62展开层63电极部64吸收层65竞争反应区域66盖体67导入部68窗部70BSA71固定化皮质醇80分析系统81测定装置82显示器90皮质醇91HRP-CORT 抗体结合体91a皮质醇抗体91bHRP100分析芯片200分析系统
具体实施例方式以下，根据附图来对本发明的实施方式进行说明。此外，在以下附图中对于相同或相当的部分，附上相同的参照符号而不重复说明。此外，在本说明书中，“液体”的概念是可以包含液体试样、反应液、清洗液及基质溶液 中的每一个。[第I实施方式]<分析芯片>图I中表示第I实施方式中的分析芯片的示意性平面图。图I中所示的分析芯片100是用来通过使用竞争反应而分析液体试样中的测定对象物质的分析芯片。在本实施方式中，是对使用皮质醇作为测定对象物质的情况进行说明，该皮质醇是肾上腺皮质类脂醇(corticoid)的一种，且作为体内浓度因压力而产生变化的激素(hormone)而被人们所知，但测定对象物质并不限定于此。参照图I，分析芯片100包括基体10、形成在该基体10表面的流路11、及配置在流路11内的载体21及吸收体22。图2及图3中表示图I的基体的示意性平面图及立体图。参照图2及图3，基体10的材质并无特别限定，优选的是透明基板。透明基板例如可以使用丙稀酸系树脂等的树脂基板，或者玻璃、娃、或石英等无机材料基板。基体10的形状并无特别限定，例如，可以设为图I中左右方向的长度为75 90mm，图I中上下方向的宽度为14 18mm,且厚度为3 IOmm的长方体。形成在基体10表面的流路11包括上游侧的导入部12、设置在导入部12的下游侧的反应部13、设置在反应部13的下游侧的排出部14、及设置在反应部13与排出部14之间的拦阻部15。此外，各图的流路11中，图中左侧(导入部12侧)为上游侧，右侧(排出部15侧)为下游侧。流路11是用来使液体试样、以及竞争反应中所使用的清洗液、基质溶液等液体从上游侧流向下游侧的流路，流路11中的相邻接的各部互相连通。这种流路11例如可以通过切削基体10的表面而形成。流路11的深度并无特别限定，例如可以设为I 5mm。此夕卜，流路11只要至少包括导入部12、反应部13、排出部14及拦阻部15即可。流路11中的导入部12形成为具有较窄的流路宽度的直线形，是可以用来将液体试样导入至流路11的部分。通过从导入部12导入液体试样，可以使液体试样流向位于导入部12的下游侧的反应部13。作为将液体试样向导入部12导入的方法，例如有如下方法，即将液体试样配置在比导入部12更靠上游侧的基体10的表面。通过以这种方式配置液体试样，可以使液体试样通过自重而落入到导入部12内，所以结果可以将液体试样导入至流路11内。另外，通过将导入部12的流路宽度W12设为较窄，可以利用毛细管现象而将液体试样以较快的速度导入至导入部12内，且可以使液体试样进一步流向反应部13。其中，如图I 3所示，优选的是使导入部12的流路宽度W12比反应部13的流路宽度W13窄，将导入部12的上游侧封闭，且使导入部12的流路长度(图I 3中的左右方向)与流路宽度W12相比足够长。通过使导入部12具有这种形状，可以使将液体试样配置在基体10表面时对液体试样的速度等运动状态的影响通过与流路壁的摩擦而平坦化(均匀化)，因而可以抑制反应部13内的竞争反应不均。例如，导入部12可以设为流路长度为10mm、流路宽度W12为Imm的直线形状。此外，在本说明书中，所谓流路宽度，是与从流路11的上游侧朝向下游侧的方向正交的方向上的流路11的宽度。如图I 图3所示，流路11中的反应部13形成为从上游侧到下游侧流路宽度连续地增大后紧接着连续地减小的形状，是可以使液体试样中的测定对象物质进行竞争反应的部分。反应部13通过具有如图I 图3所示的形状，可以使从导入部12侧流入的液体试样在反应部13内均匀地分散。例如，反应部13优选的是设为如下形状，即流路长度为12 15_，流路宽度从上游侧到下游侧自1_(导入部12的流路宽度W12)起连续地增大而最大部分的流路宽度W13达到6mm后，又连续地减少而变窄至lmm(拦阻部15的流路宽度W15)。另外，反应部13例如也可以形成为如下形状，即流路长度为12 15_，流路宽度从上游侧到下游侧自Imm起连续地增大而达到6mm后，将该最大流路宽度的部分维持规定长度例如3mm,紧接着连续地减少而变窄至1_。流路11中的拦阻部15是可以抑制液体试样从反应部13流出到排出部14的部分。通过将拦阻部15与反应部13的下游侧相邻接而配置，可以将液体试样阻留在拦阻部15的上游侧，因此可以促进在反应部13内进行均匀的竞争反应。 拦阻部15的流路宽度W15优选的是比反应部13的流路宽度W13窄。通过设为该形状，可以抑制液体试样从反应部13流出到排出部14。此时，如图I 图3所示，拦阻部15成为使反应部13的下游侧狭窄的构造。例如，可以将拦阻部15的形状设为流路长度为1mm、流路宽度W15为Imm的形状。另外，通过使构成拦阻部15的流路具有流路的表面排斥液体试样的斥液性，也可以抑制反应液从反应部13流出到排出部14。此时，例如可以通过对构成拦阻部15的基体10的壁部涂布氟而构成斥液性的拦阻部15。特别是通过如图I 图3所示般，使拦阻部15狭窄而使其流路宽度W15与反应部13的流路宽度W13相比足够窄，并且使构成拦阻部15的流路具有斥液性，可以提高抑制液体试样向排出部14流出的效果。像这样，可以通过使拦阻部15并非为例如可以开闭的阀门构造之类的复杂构造，而为像狭窄构造及/或赋予了斥液性的构造这样的简单构造，来抑制液体试样从反应部13向排出部14流动。另外，通过将拦阻部15的构造设为这种构造，在比拦阻部15靠上游侧的流路11内的液量超过规定量(拦阻部15能够抑制流出的液量)时，可使液体从反应部13向排出部14流出。这样，拦阻部15可以容易地控制有无从反应部13向排出部14的液体试样的流出。因此，通过拦阻部15抑制液体试样从反应部13向排出部14流出(设为无)，可以促进在反应部13内进行均匀的竞争反应。另一方面，通过拦阻部15可以使液体试样从反应部13向排出部14流出(设为有)，可使竞争反应后的液体试样容易地向排出部14流出，因此可以容易地将反应部13内的液体置换为竞争反应后的定量分析所需的液体。流路11中的排出部14形成为具有较宽的流路宽度的直线形，是用来将从反应部13流出来的液体试样阻留在内部而不让其逆流的部分。从反应部13经过拦阻部15而流入到排出部14的液体试样被阻留在排出部14内。因此，排出部14的形状并无特别限定，优选的是可以抑制液体试样逆流的形状。例如，可以将排出部14设为流路长度为47 59mm、流路宽度W14为8 12mm的长方形。在此情况下，因为排出部14与反应部13相比具有大的容量，所以可以抑制一旦流入到排出部14中来的液体试样等液体逆流到反应部13。另外，也可以利用载置在基体10的上表面的盖体(未图示)等将流路11封闭。在此情况下，通过在盖体的与导入部12相对应的区域的一部分设置导入口，可以将液体试样等液体简便地导入到流路11内。通过使分析芯片100在基体10的上表面(形成有流路11的面)具有盖体，可以在洁净的环境下进行分析，且可以提高分析的精度。另外，如图I所示，反应部13中收纳有载体21，该载体21上预先固定有作为测定对象物质的皮质醇的竞争物质。由此，反应部13可以发挥作为流入到反应部13内的液体试样中的皮质醇进行竞争反应的场所的功能。图4中表不用来说明载体21的构成的一例的不意图。在载体21的表面固定着BSA(牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)) 32，在BSA32上固定着作为竞争物质的皮质醇31。这种载体21例如可以通过如下方式来制作。也就是说,首先,准备作为载体21的一例的薄膜(membrane)。接着，将所准备的薄膜浸溃在包含使皮质醇和BSA结合而成的BSA-CORT结合体的溶液中进行培养，之后，将该薄膜浸溃在5% FBS(灭活胎牛血清)溶液等中进行培养。然后，在以磷酸缓冲液等对浸 溃后的薄膜进行清洗后，在室温环境下等加以干燥。此外，BSA-CORT结合体既可以使用市售品，也可以适当地制作。通过以上的处理，可以制作像图4所示那样，经过作为连接子的BSA32而固定有皮质醇31的载体21。载体21的材料并无特别限定，可以较佳地使用蛋白质的吸附能力优异的薄膜，例如包含聚苯乙烯、氯乙烯、硝化纤维素等的薄膜。另外，载体21的形状也并无特别限定，优选的是不会对反应部13内的液体的流动造成影响的形状，例如为圆形、椭圆形。此外，载体21既可以固定在反应部13内，也能够以可以更换的方式配置在反应部13内。通过将载体21以可以更换的状态配置在反应部13内，能够实现分析芯片100的重复利用，从而使分析成本降低。另外，如图I所示，优选的是在排出部14中收纳有吸收体22。吸收体22只要为可以吸收液体试样等液体的部件即可，例如优选的是包含吸收性纤维、多孔性树脂、高分子吸收体或海绵的部件。特别是可以较佳地使用聚苯乙烯、氯乙烯等。并非必须在排出部14内配置吸收体22，但通过将这种吸收体22收纳在排出部14内，可以提高排出部14的液体的吸收性能。另外，通过收纳吸收体22，可以将流入到排出部14的液体阻留在吸收体22中，因此可以有效地抑制一旦流入到排出部14的液体经过拦阻部15而逆流到反应部13。此夕卜，吸收体22既可以固定在排出部14内，也能够以可以更换的方式进行配置。如以上所说明般，根据本实施方式的分析芯片100，通过设置能够抑制液体试样从反应部13向排出部14流动的拦阻部15，可以将液体试样阻留在反应部13内，从而使反应部13内的竞争反应充分且均匀地进行。另外，在竞争反应后，能够使反应部13内的液体试样容易地流出到排出部14，所以可以容易地实现利用竞争反应的定量分析。〈分析方法〉图5是表示本发明的第I实施方式中的分析方法的流程图。图6(a) (d)是概略性地表示本发明的第I实施方式中的分析方法的各步骤的平面图。图7(a) (d)是概略性地表示本发明的第I实施方式中的分析方法的各步骤的截面图。图8(a) (C)是用来说明在第I实施方式中反应部中的竞争反应的示意图。以下，参照图5 图8，对第I实施方式中的使用分析芯片100的分析方法，更具体来说，对测定液体试样中的皮质醇的浓度的分析方法进行说明。此外，图7中示出的是沿着图I中以单点虚线表示的中心线的截面。首先,如图5所示,将所制备的反应液导入至反应部13内(步骤SI)。此外,在本实施方式中，所谓反应液，是表示含有皮质醇的浓度不明的液体试样、及具有标记部的特异性结合物质(以下，称为“标记化特异性结合物质”)的液体。作为将这种反应液导入至反应部13内的方法，例如有如下方法如图6(a)及图7(a)所示，将预先制备的在液体试样中混合标记化特异性结合物质所得的反应液40配置在导入部12上。由此,导入部12上的反应液40通过反应液40的自重而被导入至导入部12内。被导入至导入部12内的反应液40例如像图6(b)及图7(b)所示般流入到反应部13内。因导入部12的流路宽度W12较窄，所以反应液40从导入部12流入到反应部13内时的流速相对较大。反应液40的速度在具有比导入部12宽的流路宽度W13的反应部13内减速。此时，因为拦阻部15与反应部13的下游侧相邻接，所以从反应部13朝向排出部14的流动受到拦阻部15的抑制。因此，反应液40在反应部13内均匀地分散，并且被阻留在反应部13内。 另外，也可以将液体试样和含有标记化特异性结合物质的液体分别配置在导入部12上。在此情况下，依次导入至导入部12内的液体试样和含有标记化特异性结合物质的液体在流路11内混合，所以如图6(b)及图7(b)所示，可以在反应部13内作为反应液40而存在。此外，因为拦阻部15能够抑制流出的反应液40的容量根据反应部13的容量及拦阻部15的形状等而适当地产生变化，所以优选的是预先调查可以利用拦阻部15抑制流出的反应液40的液量。接着，如图5所示，在反应部13内进行竞争反应(步骤S2)。使用图8(a)及(b)对该竞争反应进行说明。参照图8(a)，在该步骤中，反应部13内存在经过BSA32而固定在载体21的表面的皮质醇(以下，称为“固定化皮质醇”)31，来自反应液40中的液体试样的皮质醇33、及标记化特异性结合物质34。另外，作为标记化特异性结合物质34，例如可以使用使作为标记的HRP (来自辣根的辣根过氧化酶(Horseradish Peroxidase)) 34b与作为特异性结合物质的皮质醇抗体34a结合而成的物质。通过使固定化皮质醇31、皮质醇33、皮质醇抗体34a存在于反应部13内，如图8(b)所示般，发生固定化皮质醇31和皮质醇33竞争着与皮质醇抗体34a结合的竞争反应。如上所述，该步骤中，可以在存在反应液40的反应部13内，使皮质醇抗体34a与固定化皮质醇31及皮质醇33均匀地进行竞争反应。此外，为了在反应部13内更均匀地进行该竞争反应，优选的是将反应液40阻留在反应部13内30秒以上，更优选的是阻留I分钟以上。接着，如图5所示，将反应部13内的反应液40排出到排出部14 (步骤S3)。具体来说，如图6(c)及图7(c)所示，以使流路11中的拦阻部15的上游侧的液量多于拦阻部15能够抑制的液量的方式，从导入部12导入清洗液41。通过将清洗液41流入到流路11内，使存在于拦阻部15的上游侧的液体的容量超过拦阻部15能够抑制的液量，可以使反应部13内的反应液40向排出部14排出。由于排出部14的流路宽度W14与拦阻部15的流路宽度W15相比足够宽，因而可以使从拦阻部15流出的反应液40以较大的流速流入到排出部14。另外，因为流入到排出部14的反应液40被吸收体22吸收，所以可以有效地抑制反应液40逆流。此外，图7(c)中概念性地表示了吸收体22中所吸收的液体22a。通过该步骤，可以使反应部13内的反应液40流出到排出部14，所以如图8(c)所示，可以将与标记化特异性结合物质34结合的皮质醇33、或未经结合的标记化特异性结合物质34从反应部13中去除。另外，此时在比拦阻部15更靠上游侧存在清洗液41 (参照图6(c)及图 7(c))。接着，如图5所示，测定选自由来自标记化特异性结合物质34的HRP34b的荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种响应(步骤S4)。该步骤例如可以通过如下方式来进行。 也就是说，如图6 (d)及图7 (d)所示，将含有标记部HRP34b的基质的基质溶液42导入至反应部13。具体来说，通过从导入部12向流路11内导入基质溶液42，而使反应部13内的清洗液41向排出部14流出，并且在反应部13内充满基质溶液42。在反应部13内，基质溶液42中的基质通过与和固定化皮质醇31结合的标记化特异性结合物质34的HRP34b进行酶促反应，而变为发出荧光的化合物、发出特殊波长的光的化合物、及吸收特殊波长的光的化合物的任一种。使用分光光度计、荧光计等检测来自这种基质的化学变化的荧光、发光及吸光中的至少一种响应并定量，由此可以算出与固定化皮质醇31结合的皮质醇抗体34a的量。然后，可以根据该皮质醇抗体34a的量而算出液体试样中的皮质醇33的量。作为HRP34b的基质,例如可以使用Amplex (注册商标)RED。Amplex (注册商标)RED为非荧光物质，通过利用HRP产生化学变化而变为荧光物质试卤灵(resorufin)。因此，通过测定来自试卤灵的荧光，可以算出与固定化皮质醇31结合的皮质醇抗体34a的量，并可以基于此来算出液体试样中的皮质醇33的浓度。另外，标记部本身也可以为发出选自由荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种响应的化合物。例如，通过将荧光素等荧光物质用作标记部，则即使不使用如上所述的基质溶液，也可以根据标记部本身的荧光强度而算出与固定化皮质醇31结合的皮质醇抗体34a的量。另外，在本实施方式的分析方法中，也可以不进行导入清洗液41的步骤。在此情况下，可以使基质溶液42过剩地流入到反应部13内，将反应液40从反应部13中排出并且在反应部13内充满基质溶液42，从而同时进行步骤S4和步骤S5。此时，由于能以一个步骤来进行步骤S4和步骤S5，所以可以使分析方法更为简易。如以上所说明般，根据本实施方式的分析方法，可以使用所述分析芯片100来简便地进行使用竞争法的定量分析。〈分析系统〉图9是表示本实施方式中的分析系统的示意图。以下，参照图9对第I实施方式中的分析系统进行说明。参照图9，分析系统200包括分析芯片100和测定装置50。测定装置50只要是可以根据选自由来自分析芯片100的反应部13的荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种响应，来定量分析液体试样中的皮质醇33的装置，则无特别限定。例如，当如上所述使用Amplex (注册商标)RED作为HRP34b的基质时，测定装置50只要为包括射出试卤灵的激发波长的光出射器51、及测定由试卤灵产生的荧光的检测器52的构成即可。在此情况下，例如可以通过将检测器52所检测出的荧光的强度与试卤灵的校准曲线加以比较，而测定液体试样中的皮质醇的浓度。另外，如图9所示，分析系统200也可以包括显示测定结果的显示器53。通过包括显示器53，测定者可以容易地确认测定结果。另外，分析系统200也可以为与个人电脑(PC, Personal Computer)相连接的构成。在此情况下，可以容易地利用PC对分析系统200的分析结果进行处理。以上，使用图I 图9对本发明的分析芯片的一实施方式、本发明的分析方法的一实施方式、及本发明的分析系统的一实施方式进行了说明。根据本发明的分析芯片，反应部13可以收纳预先固定有竞争物质的载体21，另夕卜，与反应部13的下游侧相邻接的拦阻部15可以将含有液体试样的反应液阻留在反应部13内。由此，可以在反应部13内进行均匀的竞争反应。另外，当阻留在比拦阻部15更靠上游侧的液量超过拦阻部15能够抑制向其下游侧流出的液量时，拦阻部15可以容许液体从反应部13向下游侧流出。由此，反应部13内的液体的置换变得容易，可以测定选自由基于 竞争反应的荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种。因此，根据本发明的分析芯片，利用竞争法定量测定对象物质变得容易。另外，根据本发明的分析方法，可以利用本发明的分析芯片而简便地使用竞争法对测定对象物质定量。另外，在使用微孔的分析方法中，清洗处理等的操作较为复杂，为了维持较高的定量性，其操作必须熟练，但根据本发明的分析方法，则至少可以通过调节反应液的液量而简便地维持较高的定量性。另外，根据本发明的分析系统，可以使用本发明的分析芯片及分析方法来进行使用竞争法的定量。另外，因为测定选自由荧光、发光及吸光所组成的群中的至少I种的分光光度计、荧光计之类的测定装置可以设计得较小，所以本发明的分析系统可以制成为能容易地携带的构成。因此，例如可以容易地在采集液体试样的场所进行流式检测。另外，本发明的分析芯片、分析方法及分析系统与根据试纸上的显色的有无来分析测定对象物质的有无这样的技术不同，可以测定液体中的荧光、发光或吸光而分析测定对象物质的浓度。因此，例如可以充分地降低分光测定时的背景(background)，且可以维持更高的定量性。特别是通过使用利用与标记物质的反应而变成发出荧光的化合物的基质，可以在短时间内进行高灵敏度的酶促反应，因此，可以高灵敏度且迅速地进行定量分析。另夕卜，因为与使用试纸的情况不同，可以在液体中进行竞争反应或酶促反应，所以可以降低各反应时的不均，因此可以进行更不存在不均的正确的定量分析。此外，在本实施方式中，对将液体试样中的测定对象物质(浓度不明的皮质醇)的竞争物质(浓度已知的皮质醇)固定在载体21上，将含有特异性结合物质(浓度已知的经标记的皮质醇抗体)和液体试样的反应液导入至流路11内的情况进行了说明,但本发明并不限定于此。例如，也可以将液体试样中的测定对象物质(浓度不明的皮质醇)的特定的结合物质(浓度已知的皮质醇抗体)固定在载体21上，将含有竞争物质(浓度已知的经标记的皮质醇)和液体试样的反应液导入至流路11内。在此情况下，可以通过测定来自与载体21结合的竞争物质的标记部的发光等，而分析液体试样中的皮质醇的浓度。另外，以上所述的本发明的第I实施方式的说明中，对分析皮质醇的情况进行了详细的说明，但是通过更换固定在反应部13内的载体21上的物质，可以测定能利用竞争法进行分析的其他蛋白质。
[实施例I](分析芯片)使用宽度14mm、长度75mm、厚度3mm的长方体的丙烯酸系树脂基板作为基体10。在基体10的表面形成如图I 图3所示的流路11，该流路11包含长度10mm、流路宽度Imm的导入部12，长度12mm、最大流路宽度6mm的反应部13，长度47mm、流路宽度9mm的排出部14，及长度1mm、流路宽度Imm且涂布了氟的拦阻部15。此外，将流路11的深度设为2mm。利用使用直径6mm的聚苯乙烯薄膜，在其一表面上固定BSA-CORT结合体所得的薄膜作为载体21，且利用宽度12mm、长度50mm、厚度Imm的包含纤维素的吸收体22作为吸收体。此外，载体21是以如下方式来制作。S卩，首先将聚苯乙烯薄膜浸溃在以0.8ii g/mL的浓度含有BSA-CORT结合体(Fitzgerald公司制造)的PBS(phosphate buffered saline,磷酸盐缓冲盐水)缓冲液中，在37°C下培养12个小时。然后，将该聚苯乙烯薄膜浸溃在5% FBS溶液中，在37°C下培养30分钟。之后，用PBS-T溶液清洗该聚苯乙烯薄膜，在37°C下静置干燥，由此制作载体21。将所述载体21收纳在反应部13内，将所述吸收体22收纳在排出部14内，在该基体10的上表面设置宽度14臟、长度75mm、厚度3mm的长方体的丙烯酸系树脂基板作为盖体，并用粘合剂将两者粘合以使基体10和盖体不产生偏移。此外，在盖体中与导入部12的最上游侧相对应的部分设置有直径Imm的孔作为导入口。通过以上操作，准备好分析芯片100。(反应液)准备皮质醇(Sigma-Aldrich公司制造)的浓度分别为0ng/ml、0. 01ng/ml、0. lng/ml、lng/ml、及100ng/ml的PBS溶液作为液体试样。另外，准备以0. 6 y g/ml的浓度含有标记了 HRP34b的皮质醇抗体34a的PBS缓冲液，作为标记化特异性结合物质34。然后，将各溶液(含有皮质醇的PBS溶液及含有皮质醇抗体的PBS缓冲液)以I : I混合而制备反应液。(清洗液及基质溶液)准备PBS-T作为清洗液。另外，作为基质溶液，准备在5ml的PBS溶液中含有260mg的Amplex (注册商标)RED的第I溶液、及含有包含2mM的过氧化氢的PBS溶液的第2溶液。此外，基质溶液是在即将从导入口导入至流路内之前将第I溶液和第2溶液混合而制备。(分析方法)首先，在分析芯片100的盖体的导入口上配置100 ill的反应液，将反应液导入至流路11内。导入后，反应液迅速地流入到反应部13内，并积存在反应部13内(步骤SI)。将分析芯片100在该状态下静置I分钟而在反应部13内进行竞争反应后(步骤S2)，从导入口导入500 ill的清洗液，从而将反应部13内的反应液排出到排出部14(步骤S3)。然后，从导入口导入200 ill的将第I溶液和第2溶液以I : I混合而成的基质溶液，在反应部13内进行3分钟HRP和基质的酶促反应，使用荧光计，朝向该反应部13照射波长560nm的激发光，测定波长590nm的荧光(步骤S4)。此外，可以在5分钟以内进行从开始导入反 应液到酶促反应结束为止的操作。(测定结果)将各反应液的竞争反应后的测定结果示于图10的图中。在图10中，可知随着各反应液中的皮质醇浓度增加，所测定的来自试卤灵的荧光的强度相对下降。因此，可以使用竞争反应在短期间内高灵敏度地测定皮质醇的浓度。另外，可知例如可以通过预先制成皮质醇的各浓度所对应的校准曲线等，而分析皮质醇的浓度未知的液体试样中的皮质醇浓度。[第2实施方式]<分析芯片>图11中表示实施方式中的分析芯片的示意性平面图。图11中所示的分析芯片60是用来通过使用竞争反应而分析液体试样中的测定对象物质的分析芯片。在本实施方式中，是对使用皮质醇作为测定对象物质的情况进行说明，该皮质醇是肾上腺皮质类脂醇的一种，且作为体内浓度因压力而产生变化的激素而被人们所知,但测定对象物质并不限定于此。
参照图11，分析芯片60包括基体61、展开层62、电极部63及吸收层64。另外，展开层62在与电极部63接触的部分具有竞争反应区域65。以下，对各构成具体地进行说明。基体61是用来以规定的位置关系配置展开层62、电极部63及吸收层64的基材。基体61的形状并无特别限定，例如可以设为图11中的左右方向的长度为50 70mm，图11中的上下方向的宽度为10 20mm,厚度为I 5mm的长方体。另外，图12是表示在基体61的表面设置着凹部61a的状态的示意性立体图，像这样，也可以在基体61的表面形成与展开层62、电极部63及吸收层64等的形状相对应的凹部61a。利用该构成，可以容易地在基体61上对展开层62、电极部63及吸收层64进行定位，并且可以抑制展开层62、电极部63及吸收层64发生偏移。定位变得容易并且可以抑制偏移，由此可以抑制分析芯片60的构成的不均，所以最终可以抑制分析芯片60的分析灵敏度、分析精度的不均。形成凹部61a的方法并无特别限制，例如可以使用如下方法使用具有转印构造的模具的射出成形法、压印法、切削法、蚀刻法等。基体61的材质并无特别限定，就电极部63所检测出的电化学变化稳定的观点来说，优选的是绝缘性基板。绝缘性基板例如可以使用聚对苯二甲酸乙二酯(PET, Polyethylene Terephthalate)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT, PolybutyleneTerephthalate)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA, Polymethyl Methacrylate)、聚碳酸酯(PC,Polycarbonate)、聚苯乙烯(PS, Polystyrene)、聚丙烯(PP，Polypropylene)、聚乙烯(PE, Polyethylene)、聚萘二甲酸乙二酯(PEN, Polyethylene Naphthalate)、聚芳酯树脂(PAR, Polyarylate Resin)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂(ABS, AcrylonitrileButadiene Styrene)、氯乙烯树脂(PVC, Polyvinyl Chloride)、聚甲基戍烯树月旨(PMP,polymethylpentene resin)、聚丁二烯树脂(PBD,Polybutadiene resin)、生物降解性聚合物(BP, Biodegradable Polymer)、环烯经聚合物(COP, Cycloolef in Polymer)、聚二甲基娃氧烧(PDMS, Polydimethylsiloxane)等有机材料基板,或玻璃、娃、石英等无机材料基板。展开层62是可以使液体试样从一端侧展开至另一端侧的部分。在图11所示的分析芯片60中，从展开层62中的露出在基体61上的一侧导入液体试样。因此，在本实施方式中，所导入的液体试样是从展开层62的位于图11中的左侧的一端侧展开至位于图11中的右侧的由吸收层64覆盖的另一端侧。展开层62的形状并无特别限定，例如可以设为图11中的左右方向的长度为40 60mm,图11中的上下方向的宽度为2 8mm的膜状的形状。展开层62的材料只要如上所述般可以使液体试样展开则无特别限定，但就提高分析灵敏度的观点来说，优选的是不使测定对象物质皮质醇改性的材料。例如，展开层62可以使用硝化纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF,Polyvinylidene Fluoride)、纤维素、娃石纤维、玻璃纤维等。其中，就易于固定竞争物质的观点来说，优选的是使用硝化纤维素。所述展开层62在位于一端侧与另一端侧之间的区域的一部分具有竞争反应区域65。竞争反应区域65是在展开层62的表面固定有皮质醇的竞争物质的区域，只要为位于一端侧与另一端侧之间的区域的至少一部分即可。此外，所谓皮质醇的竞争物质，是可以与皮质醇进行对于能与皮质醇特异性地结合的特异性结合物质的竞争反应的物质，例如可以使用皮质醇抗体作为特异性结合物质，使用皮质醇作为竞争物质。
图13中表示用来说明固定在竞争反应区域的竞争物质的示意图。使用图13对竞争反应区域65进行具体说明。此外，在本实施方式中是对使用皮质醇作为竞争物质的情况进行说明。参照图13，在展开层62的表面固定有BSA(牛血清白蛋白)70，在BSA70上固定有作为竞争物质的皮质醇71。展开层62中的存在皮质醇71的区域成为竞争反应区域65，通过该构成，竞争反应区域65可以发挥作为液体试样中的皮质醇的竞争反应场所的功能。此夕卜，为了避免与液体试样中的皮质醇相混淆，以下将固定在展开层62中的皮质醇71称为固定化皮质醇71。图13的竞争反应区域65例如可以通过如下方式来制作。S卩，首先准备展开层62。接着，仅在所准备的展开层62中与竞争反应区域65相对应的部分涂布包含使皮质醇和BSA结合所得的BSA-CORT结合体的PBS缓冲液后，在室温环境下等加以干燥。另外，BSA-CORT结合体既可以使用市售品，也可以适当地制作。通过以上的处理，如图13所示般形成包含固定化皮质醇71的竞争反应区域65。竞争反应区域65的形状、大小并无特别限定。例如，可以将展开层62的长度方向(图11中左右方向)上的宽度设为I 10mm，将展开层62的宽度方向(图11中上下方向)上的宽度设为I 10mm。另外，竞争反应区域65内存在的固定化皮质醇71的量也并无特别限定。返回到图11，电极部63是用来检测竞争反应区域65内的电化学变化的部分，更具体来说，是用来检测竞争反应区域65内存在的液体中所产生的电子的部分。电极部63例如可以使用在绝缘性基板上配置着包含工作电极、反电极及参考电极的电极系统的三电极方式的电极。在使用三电极方式的电极部63的情况下，以如下方式进行电化学分析。即，在电极部63与包含电子的液体接触的状态下，利用与电极部63连接的测定装置，例如恒电位器(potentiostat)兼恒流器(galvanostat)控制工作电极与参考电极之间的电压。该电位变化引起液体中的电子迁移，伴随电子迁移而产生的电流流通至工作电极中。然后，测定装置检测出在工作电极与反电极之间流通的电流变化，进而将对该电流变化进行积分计算而获得的电量(库仑(coulomb)量)或者波峰电流值或电流变化的微分值等与校准曲线进行比较，由此可以进行电化学分析。电极部63既能以电极系统和竞争反应区域65接触的方式配置在竞争反应区域65上，也可配置在展开层62中竞争反应区域65与另一端侧之间的表面上。将电极部63配置在展开层62中竞争反应区域65与另一端侧之间的表面上的情况下，优选的是配置在竞争反应区域65的附近。通过该构成，可以抑制由于竞争反应区域65内存在的液体中所产生的电子在从竞争反应区域65向另一端侧展开期间消失而导致分析芯片60的检测灵敏度下降。另外，优选的是如图11所示般以电极部63的一部分位于比基体61的外周更靠外侧的方式来配置电极部63，以使得电极部63和测定装置容易电性连接。电极部63的材质并无特别限定，可以使用众所周知的材料。例如电极部63中，基板只要为绝缘性基板即可，可以使用聚乙烯、聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯等。另外，优选的是基板具有柔软性，可以变形，从而容易与测定装置电性连接。另外，电极部63中，电极系统只要由导电体形成即可，例如可以使用钼、碳、金、银、钯、钌、铑等。另外，工作电极也可以为包含下述酶促反应所需的电子传递介质的电极。吸收层64是为了将展开至展开层62的另一端侧的液体吸收而设置的部分。因此，吸收层64优选的是配置成与展开层62的另一端侧接触，更优选的是如图11所示，配置成覆盖展开层62的另一端侧。在分析芯片60中，因为配置在另一端侧的表面上的吸收层64可以将展开至另一端侧的液体吸收，所以可以增加液体的展开速度，从而可以迅速地进行分析。 吸收层64的形状并无特别限定，就提高吸收能力的观点来说，优选的是可以具有大的液体吸收能力的大小。因此，可以设为体积大于所接触的展开层62的体积的形状，例如设为图11中的左右方向的长度为20 80mm，图11中的上下方向的宽度为5 10mm，厚度为I 3mm的形状。吸收层64的材料只要是可以吸收液体的材料即可，例如可以使用包含吸收性纤维、多孔性树脂、高分子吸收体或海绵的部件。特别是可以较佳地使用聚苯乙烯、氯乙烯等。另外，分析芯片60也可以如图14及图15所不般包含盖体66。另外，图14是分析芯片的另一形态的示意性平面图，图15是图14的分析芯片的示意性立体图。参照图14及图15，盖体66是以覆盖配置在基体61上的展开层62、电极部63及吸收层64的方式而配置在基体61上。盖体66既可以载置在基体61上,也可以利用粘合剂、螺钉等将盖体66和基体61相互固定。另外，在盖体66中与展开层62的一端侧相对应的位置上，设置有用来将液体试样导入至一端侧的导入部67。通过分析芯片60包含盖体66，可以抑制灰尘等附着在展开层62上，因此可以在更洁净的环境下进行分析，结果可以提高分析精度、分析灵敏度。另外，如图14及图15所不,优选的是电极部63的一部分从基体61与盖体66之间露出。通过该构成，变得容易在电极部63上电性连接测定装置。另外，也可以在盖体66中与位于展开层62上的电极部63相对应的位置具有窗部68，以便可以容易地从外部接触位于展开层62上的电极部63。〈分析系统〉图16是表示本实施方式中的分析系统的示意图。以下，参照图16对本发明的分析系统的一形态进行说明。参照图16，分析系统80包括分析芯片60、测定装置81及显示器82。测定装置81是与分析芯片60的电极部63电性连接，用来测定电极部63所检测出的电化学变化的装置，该测定装置81具有如下功能控制电极部63的工作电极与参考电极之间的电位，检测所接触的液体中产生的响应电流，及对所检测出的响应电流进行运算而将其数值化。另外，分析系统80通过包含显示器82，可以显示数值化的结果。显示器82并非必需，例如测定装置81自身也可以包含显示器，还可以代替显示器82而包含印刷数值化的结果的打印机。另外，还可以在测定装置81上连接个人电脑。〈分析方法〉图17是表示实施方式中的分析方法的流程图。图18(a) (C)是用来说明竞争反应区域内的竞争反应的示意图。以下，参照图11、图17及图18，对本发明的分析方法、SP使用包含所述分析芯片60和测定装置81的分析系统来分析液体试样中的皮质醇的分析方法的一形态进行说明。首先，如图17所示，向展开层62的一端侧导入含有具有标记部的特异性结合物质和液体试样的反应液(步骤S21)。所谓具有标记部的特异性结合物质，是在可与测定对象物质皮质醇特异性地结合的物质上结合酶等标记部而获得。本实施方式中使用作为特异性结合物质的皮质醇抗体91a和作为标记部的HRP (来自辣根的辣根过氧化酶)91b结合而成的HRP-CORT抗体结合体91 (参照图18 (a))。
作为将反应液导入至展开层62的一端侧的方法，有从展开层62的一端侧的上方滴下反应液的方法。在此情况下，通过反应液的自重及/或毛细管现象，而将反应液导入至展开层62的一端侧。另外，也可以使用注射器等将反应液直接注入到展开层62的一端侧。接着，如图17所示，使所导入的反应液展开至展开层62的竞争反应区域65为止(步骤S22)。在分析芯片60中，因为在展开层62的另一端侧配置着吸收层64，所以可以利用毛细管现象而使导入至展开层62的一端侧的反应液从展开层62的一端侧高效率地展开至竞争反应区域65。接着，如图17所示，在竞争反应区域65中，使反应液和竞争反应区域65内的固定化皮质醇71进行竞争反应(步骤S23)。使用图18(a)及(b)对该步骤中的竞争反应进行说明。参照图18(a)，该步骤中，在展开有反应液的竞争反应区域65内存在固定化皮质醇71、来自反应液中的液体试样的皮质醇90、及HRP-CORT抗体结合体91。通过固定化皮质醇71、皮质醇90、HRP-C0RT抗体结合体91存在于竞争反应区域65内，如图18(b)所示，发生固定化皮质醇71和皮质醇90竞争着与HRP-CORT抗体结合体91的皮质醇抗体91a结合的竞争反应。此外，皮质醇90存在越多，则与固定化皮质醇71结合的HRP-CORT抗体结合体91的量越少。接着，如图17所示，向展开层62的一端侧导入含有基质的基质溶液(步骤S24)。基质只要是通过与HRP的酶促反应而生成电子的物质即可，例如可以使用过氧化氢等。基质溶液的溶剂并无特别限定，例如可以使用PBS缓冲液、HEPES (hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid,轻乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲液、甘氨酸盐酸缓冲液等。另外，因过氧化氢和HRP的酶促反应可以通过使用二茂铁或铁氰化钾等电子传递介质而将响应放大，所以基质溶液中也可以同时含有基质和电子传递介质。在本实施方式中，对使用同时含有过氧化氢和二茂铁的基质溶液的情况进行说明。接着，如图17所示，使所导入的基质溶液展开至竞争反应区域65为止(步骤S25)。在分析芯片60中，因为在展开层62的另一端侧配置着吸收层64，所以可以利用毛细管现象而使导入至展开层62的一端侧的基质溶液从展开层62的一端侧高效率地展开至竞争反应区域65。
另外，通过增加所展开的基质溶液的量，例如设为反应液的2 5倍的容量，可以使与固定化皮质醇71结合的HRP-CORT抗体结合体91以外的物质高效率地展开至展开层62的另一端侧，因此可以提高分析精度及分析灵敏度(参照图18(c))。也就是说，该情况下的基质溶液可以兼具清洗液的功能。另外，与固定化皮质醇71结合的HRP-CORT抗体结合体91以外的物质的含义除了皮质醇90、游离的HRP-CORT抗体结合体91以外，还包含反应液中所含的其他物质。
接着，如图17所示，在竞争反应区域65内，使与固定化皮质醇71结合的HRP-抗体结合体91的HRP91b和所展开的基质溶液进行酶促反应(步骤S26)。二茂铁通过与HRP的酶促反应，而与水和氧产生化学变化，伴随着该化学变化，在竞争反应区域65内存在的基质溶液中生成电子。接着，如图17所示，检测出来自酶促反应的电化学变化(步骤S27)。具体来说，由电极部63检测出来自通过所述酶促反应而在竞争反应区域65内生成的电子的响应电流。然后，与电极部63电性连接的测定装置81测定响应电流并将其数值化，由此可以算出竞争反应区域65内有无HRP-CORT抗体结合体91及其量。然后，可以根据所算出的HRP-CORT抗体结合体91的量而算出与皮质醇90结合的HRP-CORT抗体结合体91的量，所以最终可以分析出皮质醇90的量。另外，通过与校准曲线等进行比较，可以算出皮质醇90的浓度、绝对量等，因此最终也可以对液体试样中的皮质醇90进行定量。另外，在该步骤中，就使来自酶促反应的响应电流变得稳定的观点来说，优选的是在进行所述步骤S24、S25及S26期间，从展开层62的一端侧持续导入基质溶液。另外，通过在进行步骤S27期间也从展开层62的一端侧持续导入基质溶液，可以进行更稳定的分析。如上所述，通过进行步骤S21 S27，可以对液体试样中的皮质醇进行定量分析。另外，在本实施方式的分析方法中，也可以在步骤S23与步骤S24之间，进一步进行从展开层62的一端侧导入清洗液的步骤，及使所导入的清洗液展开至竞争反应区域65为止的步骤。清洗液例如可以使用PBS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸盐酸缓冲液。通过在步骤S23后进行从展开层62的一端侧导入清洗液的步骤，及使所导入的清洗液展开至竞争反应区域65为止的步骤，可以使竞争反应区域65内存在的皮质醇90、游离的HRP-CORT抗体结合体91等移动至展开层62的另一端侧。以上，使用图11 图18对本发明的第2实施方式中的分析芯片的一形态、分析方法的一形态及分析系统的一形态进行了说明。根据所述分析芯片60，通过在展开层62上设置存在固定化皮质醇71的竞争反应区域65，仅借由展开反应液即可简便且迅速地进行竞争反应。进而，通过在竞争反应区域65上、或竞争反应区域65的附近设置电极部63，可由电极部63容易地检测出伴随着酶促反应而在竞争反应区域65内生成的电子所引起的电流。因此，借由分析芯片60最终可以简便地对液体试样中的皮质醇90进行定量分析。例如，在电极部上固定抗体、竞争物质等的方法中，具有可以结合的蛋白质有限的倾向，而且具有其结合量也相对较少的倾向。相对于此，根据所述分析芯片60，因为是在展开层62中固定作为竞争物质的固定化皮质醇71，所以可以牢固地固定，并且容易调整其结合量。另外，为了提高展开层62的展开能力，优选的是使用多孔形状的膜来作为展开层62，此时，也可以在多孔形状的内部固定竞争物质。在此情况下，可以使展开至竞争反应区域65的反应液中所存在的皮质醇90更均匀地进行竞争反应。因此，可以进行灵敏度更高的定量分析。另外，例如在使用唾液作为液体试样时，因液体试样中的皮质醇浓度相对较低，且其容量也较小，所以优选的是在展开时液体试样不损失地使其全部量到达至竞争反应区域65。在使用分析芯片60进行竞争反应的情况下，只要使液体试样等液体从展开层62的一端侧展开至另一端侧即可。换言之，分析芯片60不具有难以使液体试样均匀地到达至竞争反应区域65这样的复杂构成。因此，在使用分析芯片60进行的液体试样的分析中，能够抑制液体试样的损失。另外，根据所述分析系统，可以简便地使用竞争法对测定对象物质定量。另外，测定装置81例如可以使用恒电位器、电流分析器等。因为这些装置可以设计得较小，所以本发明的分析系统可以制成为能容易地携带的构成。因此，例如可以容易地在采集液体试样的场所进行流式检测。 另外，根据所述分析方法，可以利用本发明的分析芯片而简便地使用竞争法对测定对象物质定量。特别是在所述分析方法中，因为是使用抗原抗体反应和酶促反应来测定有无测定对象物质皮质醇及其量，所以可以高灵敏度地进行定量分析。另外，在使用微孔的分析方法中，清洗处理等的操作较为复杂，为了维持高定量性，其操作必须熟练，但根据本发明的分析方法，则可简便地维持高定量性。此外，所述实施方式中是使用HRP作为标记部，但使用的标记部并不限定于此，只要是在酶促反应中引起生成电子的化学反应的酶即可，例如也可以使用葡萄糖氧化酶。在此情况下，基质溶液中所包含的基质可以使用葡萄糖。另外，在所述实施方式中，对分析皮质醇的情况进行了详细说明，但是通过更换固定在竞争反应区域65内的物质，可以测定能以竞争法进行分析的其他蛋白质。[实施例2]在本实施例中，使用图13及图14中所示的分析芯片60来分析液体试样中的皮质醇浓度。以下对具体内容进行说明。(分析芯片及分析系统)准备宽度18mm、长度69臟、厚度3. 5mm的丙烯酸系树脂基板作为基体61，如图11所示，在基体61的表面形成与展开层62、电极部63及吸收层64等的形状相对应的凹部61a。使用宽度5mm、长度55mm的硝化纤维素薄膜作为展开层62，在长度方向的中央的区域(宽度6mm、长度Imm)固定BSA-CORT结合体，形成竞争反应区域65。此外，竞争反应区域65是以如下方式来制作。S卩，首先在硝化纤维素薄膜中与竞争反应区域65相对应的区域，涂布以0. g/ml的浓度含有BSA-CORT结合体(Fitzgerald公司制造)的PBS缓冲液。然后，将该PBS缓冲液在37°C下培养I个小时，由此制作竞争反应区域65。准备Azbio公司制造的介电泳芯片(DEP Chip, dielectrophoretic chip)电极作为电极部63，准备宽度8mm、长度35mm的纤维素纤薄膜作为吸收层64。另外，准备宽度18mm、长度69mm、厚度2mm的丙烯酸系树脂基板来作为盖体66。在盖体66中当使外周一致地载置在基体61上时与展开层62的一端侧相对应的位置、及与位于展开层62上的电极部63相对应的位置，分别设置作为导入部67及窗部68的开口部。沿着所准备的基体61上的凹部61a配置展开层62，之后以覆盖展开层62的另一端侧的方式配置吸收层64。然后，在展开层62的竞争反应区域65上配置电极部63。此外，将电极部63的一部分配置成位于比基体61的外周更靠外侧。然后，以使基体61的外周和盖体66的外周一致的方式，在基体61上载置盖体66，且使用螺钉将基体61及盖体66的外周部分固定。通过以上操作，准备好分析芯片60。然后，在分析芯片60的露出的电极部63上，电性连接北斗电工公司制造的电位测
定装置。(反应液)将皮质醇(Sigma-Aldrich公司制造)的浓度分别为0ng/ml、50ng/ml及IOOng/ml的PBS缓冲液各准备Iml来作为液体试样。然后，准备浓度为0. 67 u g/ml的HRP-CORT抗体结合体91 (Fitzgerald公司制造)来作为标记化特异性结合物质，将该HRP-CORT抗体结合体91分别添加Iml到所述各液体试样Iml中。以下，将在皮质醇的浓度为Ong/ml的PBS缓冲液中添加HRP-CORT抗体结合体91所得的反应液称为反应液1，将在皮质醇的浓度为50ng/ml的PBS缓冲液中添加HRP-CORT抗体结合体91所得的反应液称为反应液2，将在皮质醇的浓度为100ng/ml的PBS缓冲液中添加HRP-CORT抗体结合体91所得的反应液称为反应液3。(基质溶液)准备含有I. 5mmol/l的过氧化氢的溶液来作为基质溶液。此外，基质溶液的溶剂为PBS缓冲液。(分析方法)首先，从分析芯片60的盖体66的导入部67朝向展开层62的一端滴下100 U I所准备的反应液1，从而将反应液I导入至展开层62的一端。导入至展开层62的一端的反应液I通过自重及毛细管现象，而从展开层62的一端朝向竞争反应区域65展开。与此相伴，在竞争反应区域65内产生竞争反应。然后，将滴下反应液I时的时间设为0分钟，滴下后经过5分钟后，以与反应液I相同的方法，向展开层62的一端导入150 u I所准备的基质溶液。然后，将滴下基质溶液时设为0秒，其后立刻一面使用电化学测定装置(北斗电工公司制造)对电极部63施加600mV的电压，一面对竞争反应区域65内所产生的电流测定400秒。对反应液2及3也分别进行相同的分析。(测定结果)将各反应液I 3的竞争反应后的测定结果示在图19中。如图19所示,得出反应液中的皮质醇浓度越大，则从电极部63输出的电流值越小的结果。因此，可知通过使用分析芯片60来进行竞争反应，可以简便且高灵敏度地分析皮质醇的浓度。另外，可知例如可以通过预先制成与皮质醇的各浓度相对应的校准曲线等，而对皮质醇的浓度未知的液体试样中的皮质醇浓度进行定量。此外，参照图19，可以理解在滴下基质溶液后200秒左右基质溶液到达至竞争反应区域65，在250秒左右基质溶液中的基质和HRP91b的酶促反应变得稳定。[工业上的利用性]
本发明的分析芯片、分析方法及分析系统可以较佳地利用 于使用竞争法对测定对象物质定量。
权利要求
1.一种分析芯片，其特征在于用来分析液体试样中的测定对象物质，且包括 基体、及形成在该基体表面的用来使所述液体试样从上游侧流向下游侧的流路； 所述流路包括导入部，用来将所述液体试样导入至所述流路；反应部，设置在该导入部的下游侧，用来使所述液体试样进行竞争反应；排出部，设置在该反应部的下游侧；及拦阻部，设置在所述反应部与所述排出部之间，用来抑制所述液体试样从所述反应部流到所述排出部；且 所述反应部中收纳着预先固定有与所述测定对象物质特异性地结合的特异性结合物质或所述测定对象物质的竞争物质的载体。
2.根据权利要求I所述的分析芯片，其特征在于 所述拦阻部的流路宽度比所述反应部的流路宽度窄。
3.根据权利要求I或2所述的分析芯片，其特征在于 构成所述拦阻部的流路具有斥液性。
4.根据权利要求I或2所述的分析芯片，其特征在于 所述导入部的流路宽度比所述反应部的流路宽度窄。
5.根据权利要求I或2所述的分析芯片，其特征在于 所述排出部中收纳有吸收体，该吸收体用来吸收从所述反应部流出的所述液体试样。
6.—种分析系统,其特征在于包括 根据权利要求I至5中任一项所述的分析芯片 '及 分析装置，用来根据选自由所述分析芯片的所述反应部所产生的荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种响应，来分析所述测定对象物质。
7.一种分析方法，其特征在于使用根据权利要求I至6中任一项所述的分析芯片来分析液体试样中的测定对象物质，且包括如下步骤 将含有具有标记部的特异性结合物质或具有所述标记部的竞争物质、与所述液体试样的反应液导入至所述反应部内； 在所述反应部内，使所述反应液和预先固定在所述载体上的所述特异性结合物质或所述竞争物质进行竞争反应； 在所述竞争反应的步骤之后，使所述反应液流出到所述排出部 '及在所述流出的步骤之后，根据选自由来自残留在所述反应部内的具有所述标记部的竞争物质或具有所述标记部的特异性结合物质的荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种响应，来分析所述测定对象物质。
8.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于 所述导入的步骤包含从所述导入部导入所述反应液的步骤。
9.根据权利要求7或8所述的分析方法，其特征在于 所述流出的步骤包含使清洗液流入到所述反应部的步骤。
10.根据权利要求7或8所述的分析方法，其特征在于 所述标记部发出选自由荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种响应。
11.根据权利要求7或8所述的分析方法，其特征在于 所述分析步骤包含使含有与所述标记部进行酶促反应的基质的基质溶液流入到所述反应部的步骤，所述基质是通过与所述标记部进行酶促反应，而引起选自由荧光、发光及吸光所组成的群中的任一种响应的物质。
12.—种分析芯片，其特征在于用来分析液体试样中的测定对象物质，且包括 基体； 展开层，配置在所述基体上，可以使所述液体试样从一端侧展开至另一端侧 '及 吸收层，配置成与所述展开层的所述另一端侧接触；且 所述展开层包含竞争反应区域，该竞争反应区域为位于所述一端侧与所述另一端侧之间的区域的至少一部分，且固定有所述测定对象物质的竞争物质， 所述展开层中，在所述竞争反应区域上、或所述竞争反应区域与所述另一端侧之间的表面上，还包括用来检测所述竞争反应区域内的电化学变化的电极部。
13.根据权利要求12所述的分析芯片，其特征在于 还包括配置在所述基体上的盖体，且所述盖体在与配置在所述基体上的所述展开层的所述一端侧相对应的位置上，设置了用来将所述液体试样导入至所述一端侧的导入部。
14.根据权利要求13所述的分析芯片，其特征在于 所述电极部的一部分从所述基体与所述盖体之间露出。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的分析芯片，其特征在于 所述测定对象物质为皮质醇。
16.—种分析系统,其特征在于包括 根据权利要求12至15中任一项所述的分析芯片；及 测定装置，与所述分析芯片的所述电极部电性连接，用来测定所述电极部所检测出的电化学变化。
17.一种分析方法，其特征在于使用根据权利要求12至15中任一项所述的分析芯片，来分析液体试样中的测定对象物质，且包括如下步骤 将含有具有标记部的特异性结合物质和所述液体试样的反应液导入至所述展开层的所述一端侧； 使所述反应液展开至所述展开层的所述竞争反应区域； 在所述竞争反应区域内，使所述反应液和所述竞争物质进行竞争反应； 在所述竞争反应的步骤之后，将含有基质的基质溶液导入至所述展开层的所述一端侧； 使所述基质溶液展开至所述竞争反应区域； 在所述竞争反应区域内，使所述基质溶液和所述标记部进行酶促反应；及 检测来自所述酶促反应的电化学变化。
18.根据权利要求17所述的分析方法，其特征在于 在所述竞争反应的步骤与所述导入基质溶液的步骤之间，还包括从所述展开层的所述一端侧导入清洗液的步骤，以及使所述清洗液展开至所述竞争反应区域的步骤。
全文摘要
本发明涉及一种分析芯片、分析系统及分析方法，特别是提供一种可供进行利用竞争反应的定量分析的分析芯片。本发明的分析芯片是用来分析液体试样中的测定对象物质，且包括基体、及形成在该基体表面的用来使所述液体试样从上游侧流向下游侧的流路。流路包括导入部，用来将液体试样导入至流路；反应部，设置在该导入部的下游侧，用来使液体试样进行竞争反应；排出部，设置在该反应部的下游侧；及拦阻部，设置在反应部与排出部之间，用来抑制所述液体试样从反应部流到排出部。反应部中收纳着预先固定有与测定对象物质特异性地结合的特异性结合物质或测定对象物质的竞争物质的载体。
文档编号G01N21/63GK102680441SQ201210066100
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月14日 优先权日2011年3月16日
发明者丹羽 大介, 今井 义胜 申请人:罗姆股份有限公司