专利名称：用于预测肺腺癌生存时间的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预测肺腺癌生存时间功能的试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术：
肺癌是世界范围内常见的癌症且是导致癌症患者死亡的主要原因之一。在我国肺癌发病率和死亡率高居各恶性肿瘤之首。根据世界卫生组织国际肿瘤研究所(TheInternational Agency for Research on Cancer, IARC)统计，我国 2008 年肺癌发病率为35/10万人，并且该机构估计至2025年，我国将每年新增肺癌100万例。根据卫生部2010年卫生统计年鉴，截止2009年，全国肺癌死亡率为30. 83/10万人，高于第二高死亡率的肝癌逾4/10万人。肺癌一般分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)两种组织学类型。非小细胞肺癌约占所有肺癌病例数的85%，并进一步分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌等。在过去的30年中，我国肺癌组织学类型发生改变，自1970年起，腺癌发病率快速增长，并逐步取代鳞癌，成为我国肺癌最常见类型。患者在确诊肺癌时，超过半数的人已经出现转移病灶，其中仅15%的患者生存时间大于或等于5年，尽管肺癌的5年生存率只有15%，但仅占16%的早期诊断为肺癌的患者其5年生存率可达到49%。目前的影像学和病理学的技术和方法，多运用于筛查和确诊肺癌，尽管具有一定敏感性，但对降低肺癌患者病死率的作用不大；而发展特异性细胞因子标志物作为预测肺腺癌患者生存时间的方法，可以有效地筛选出治疗肺癌的生物学靶点，同时为临床医生提供一项治疗效果的客观指标。因此，探索具有预测生存周期价值的新型简易生物标记物不仅有益于提高肺癌患者的治疗效果和生存周期，还会带来巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于预测肺腺癌生存时间的试剂盒。为了达到上述目的，本发明提供了一种用于预测肺腺癌生存时间的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，PH值为9. 6的碳酸盐缓冲液，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；其中，所述的细胞因子为包括趋化因子配体28，皮肤T细胞虏获趋化因子，人生长调节致癌基因，白介素-29，可与糖蛋白D竞争疱疹病毒进入T细胞位点的TNF样诱导蛋白，单核细胞趋化因子-4，巨噬细胞刺激蛋白a，胸腺表达趋化因子在内的8种细胞因子。优选地，所述pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液为将I. 59克碳酸钠和2. 93克碳酸氢钠加至IL蒸馏水中而得。优选地，所述pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液为将0. 2克磷酸二氢钾，2. 9克十二水合磷酸氢二钠，8. 0克氯化钠，0. 2克氯化钾，0. 5mL吐温-20加至IL蒸馏水中而得。优选地，所述的血清蛋白稀释液为将0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液而得。优选地，所述的终止液为2M硫酸溶液。优选地，所述的四甲基联苯胺底物溶液为将0. 5mL溶液浓度为10mg/5mL的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液，IOmL pH值为5. 0的底物缓冲液与32uL体积浓度为0. 75vol %的过氧化氢水溶液混合而得；其中，所述pH值为5.0的底物缓冲 液为含0.2M磷酸氢二钠和0. IM柠檬酸的蒸馏水溶液。本发明的优点是I、本发明首次提出包括趋化因子、炎症相关因子，以及免疫细胞因子等多种细胞因子类别在内的8种细胞因子或与其它临床指标组合可成为预测肺腺癌生存时间的主要指标。2、包括趋化因子、炎症相关因子，以及免疫细胞因子等多种细胞因子类别在内的8种细胞因子作为预测生存时间指标较目前用于诊断肺腺癌的影像学和病理学技术及其它临床指标更为客观，而且测定此类蛋白表达水平简单易行可靠。
具体实施例方式为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，作详细说明如下。实施例一种用于预测肺腺癌生存时间的试剂盒，由细胞因子及其酶标抗体，pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液，PH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；其中，所述的细胞因子为包括趋化因子配体28，皮肤T细胞虏获趋化因子，人生长调节致癌基因，白介素-29，可与糖蛋白D竞争疱疹病毒进入T细胞位点的TNF样诱导蛋白，单核细胞趋化因子-4，巨噬细胞刺激蛋白a，胸腺表达趋化因子在内的8种细胞因子。所述pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液为将I. 59克碳酸钠和2. 93克碳酸氢钠加至IL蒸馏水中而得。所述PH值为7. 4的磷酸盐缓冲液为将0. 2克磷酸二氢钾，2. 9克十二水合磷酸氢二钠，8. 0克氯化钠，0. 2克氯化钾，0. 5mL吐温-20加至IL蒸馏水中而得。所述的血清蛋白稀释液为将0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液而得。所述的终止液为2M硫酸溶液。所述的四甲基联苯胺底物溶液为将0. 5mL溶液浓度为10mg/5mL的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液，IOmL pH值为5. 0的底物缓冲液与32uL体积浓度为0. 75V01%的过氧化氢水溶液混合而得，所述pH值为5. 0的底物缓冲液为含0. 2M磷酸氢二钠和0. IM柠檬酸的蒸馏水溶液。上述试剂盒的使用方法如下I、包被用0. 05M pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液将细胞因子稀释至蛋白质含量为l-10ug/mL。在每个聚苯乙烯的反应孔中加0. ImL,于4°C过夜。次日，弃去孔内溶液，用pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。2、加样分别加一定血清蛋白稀释液稀释后的待检样品、正常人血清和阳性对照血清0. ImL至上述已包被的反应孔中，置37°C孵育I小时后用pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。
3、加辣根过氧化物酶标抗体在各反应孔中加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标抗体0. ImL, 37°C孵育0. 5-1小时后用pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。4、加底物液显色在各反应孔中加入四甲基联苯胺底物溶液0. lmL，37°C下孵育10-30分钟。5、终止反应在各反应孔中加入2M硫酸0. 05mL。6、结果判定在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。若大于规定的阴性对照OD值2. I倍，即为阳性。
以正常对照品蛋白表达水平作为衡量标准，肺腺癌患者血清蛋白谱表达量除以此标准，并结合生存时间的信息，从而确定患者血清蛋白谱中与生存时间相关的细胞因子。其中，大于或等于2. 4为增高，小于2. 4为降低。本发明通过收集经过临床病理诊断确诊为肺癌的有482例患者，再根据病理类型区分，确定为肺腺癌的患者276例，通过随机化方法抽样了 29例肺腺癌患者血清，并完成为期2年的生存时间随访。同时在992名健康志愿者的血清库中，通过随机化方法抽样了 14例正常人血清。应用蛋白质芯片技术检测血清内40种细胞因子，采用Stepwise多因素回归分析及Kaplan-Meier生存分析,筛选肺腺癌患者血清蛋白谱中与生存时间相关的细胞因子(P < 0. 05)。最终确定肺腺癌患者血清蛋白谱中有8种细胞因子表达与生存时间存在相关型，包括4种细胞因子正相关和4种细胞因子负相关(如表I所示)。表I多种细胞因子在肺腺癌患者与正常人血清中与生存时间的相关性
权利要求
1.一种用于预测肺腺癌生存时间的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，PH值为9. 6的碳酸盐缓冲液，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成； 其中，所述的细胞因子为包括趋化因子配体28，皮肤T细胞虏获趋化因子，人生长调节致癌基因，白介素-29，可与糖蛋白D竞争疱疹病毒进入T细胞位点的TNF样诱导蛋白，单核细胞趋化因子-4，巨噬细胞刺激蛋白a，胸腺表达趋化因子在内的8种细胞因子。
2.如权利要求I所述的用于预测肺腺癌生存时间的试剂盒，其特征在于，所述PH值为9.6的碳酸盐缓冲液为将I. 59克碳酸钠和2. 93克碳酸氢钠加至IL蒸馏水中而得。
3.如权利要求I所述的用于预测肺腺癌生存时间的试剂盒，其特征在于，所述PH值为7.4的磷酸盐缓冲液为将0. 2克磷酸二氢钾，2. 9克十二水合磷酸氢二钠，8. O克氯化钠，0. 2克氯化钾，0. 5mL吐温-20加至IL蒸馏水中而得。
4.如权利要求I所述的用于预测肺腺癌生存时间的试剂盒，其特征在于，所述的血清蛋白稀释液为将0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液而得。
5.如权利要求I所述的用于预测肺腺癌生存时间的试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2M硫酸溶液。
6.如权利要求I所述的用于预测肺腺癌生存时间的试剂盒，其特征在于，所述的四甲基联苯胺底物溶液为将0. 5mL溶液浓度为10mg/5mL的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液，IOmLPH值为5. 0的底物缓冲液与32uL体积浓度为0. 75V01%的过氧化氢水溶液混合而得； 其中，所述pH值为5. 0的底物缓冲液为含0. 2M磷酸氢二钠和0. IM柠檬酸的蒸馏水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种用于预测肺腺癌生存时间功能的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；所述的细胞因子为包括趋化因子，炎症相关因子，免疫细胞因子等多种细胞因子类别在内的8种细胞因子。本发明可协助预测肺腺癌生存周期。
文档编号G01N33/574GK102749449SQ20121026430
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者杨达伟, 王向东, 白春学 申请人:复旦大学附属中山医院