一种利用细菌全细胞生物传感器检测铜浓度的方法

一种利用细菌全细胞生物传感器检测铜浓度的方法
【专利摘要】本发明提供一种用于铜离子浓度检测的恶臭假单胞菌生物传感器，以及利用所述生物传感器定量检测水溶液中铜离子浓度的方法。所述生物传感器采用荧光蛋白所发荧光作为检测信号，采用铜特异性操纵子（启动子）序列调控荧光蛋白的表达，将铜离子浓度信号转化为荧光强度信号，通过对荧光蛋白荧光强度的检测达到检测铜离子浓度的目的。
【专利说明】—种利用细菌全细胞生物传感器检测铜浓度的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物监测【技术领域】，具体为一种利用细菌全细胞生物传感器定量检测水溶液中铜离子浓度的技术。【背景技术】
[0002]随着市现代工业的高速发展，采矿、电镀、印刷电路板等行业中产生大量的含铜废水，对环境造成严重污染。水溶液中铜离子浓度的仪器检测方法包括原子吸收法、等离子发射光谱法、电化学极谱法、和分光光度法等，以上方法具有成本高、操作繁琐、耗时长等缺点。因此，开发成本低、操作简便、快速的定量检测铜的方法是一个关键问题。
[0003]与传统的仪器分析方法相比，生物传感器具有以下特点:1)体积小、响应快、准确度高，可以实现连续在线检测；2)—般不需进行样品的预处理，可将样品中被测组分的分离和检测统一为一体，使整个测定过程简便迅速，容易实现自动分析；3)可进行活体分析；4)成本远低于大型分析仪器，便于推广普及。
[0004]细菌在获取生长所需金属的同时，面临着被高浓度金属所毒害的威胁。细菌的重金属抵抗(Heavy metal resistance,HER)系统负责对这些有害金属进行排除或解毒。细菌面对胞内条件变化而执行适当细胞应答的关键机制是对转录起始的控制。许多细菌持有特定金属离子调控的转录调控机制。结合特定金属的蛋白识别并结合启动子当中或附近的特定DNA序列,MerR家族蛋白就是这种转录调控蛋白之一。MerR家族蛋白中，CueR蛋白能够特异性识别铜离子，并在铜离子诱导的情况下调控相应铜抵抗基因的转录。本发明以CueR调控系统为基础，构建恶全细胞生物传感器，达到检测铜浓度的目的。

【发明内容】

[0005]提供一种用于铜离子浓度检测的细菌全细胞生物传感器，以及利用所述生物传感器定量检测水溶液中铜离子浓度的方法。
[0006]所述生物传感器采用绿色荧光蛋白(或其他易于检测的荧光蛋白)所发荧光作为检测信号。
[0007]所述生物传感器采用铜特异性操纵子(启动子)序列调控绿色荧光蛋白的表达，将铜离子浓度信号转化为荧光强度信号，通过对绿色荧光蛋白荧光强度的检测达到检测铜离子浓度的目的。
【专利附图】

【附图说明】
[0008]图1是质粒构建示意图；
图2是本发明实施例中测得的荧光强度随铜离子浓度变化曲线图。
【具体实施方式】
[0009]本发明所用宿主菌包括但不限于恶臭假单胞菌，以下实施例中，宿主菌为恶臭假单胞菌:
生物传感器的制备:
利用聚合酶链式反应(PCR)技术，以具有铜特异性操纵子序列(见核苷酸或氨基酸序列表)的细菌基因组DNA为模板，扩展所述操纵子(启动子)序列，将所述操纵子(启动子)序列和绿色荧光蛋白编码基因构建入表达质粒，使得操纵子序列位于绿色荧光蛋白编码基因上游(见图1)。
[0010]所述操纵子(启动子)序列和绿色荧光蛋白编码基因序列除用聚合酶链式反应方法获得外，还可用人工化学合成以及其他该领域技术人员所常用的方法。
[0011]将构建好的表达质粒按如下方法转化入恶臭假单胞菌:
1)取生长良好的对数期恶臭假单胞菌菌液，4°C条件下3000Xg离心5分钟，弃上清；
2)用1/2体积的预冷的0.1M CaCl2重悬，4°C条件下3000 Xg离心5分钟，弃上清；
3)用1/10体积的含20%甘油的0.1M CaCl2重悬菌体，制成恶臭假单胞菌感受态细胞；
4)取质粒0.1-0.g加入到100 ill感受态细胞，混匀，冰置I小时(多余的感受态细胞可放置-80°C冻存)；
5)42°C水浴热激2分钟；
6)冰置2分钟；
7)加入900ill无菌LB培养基(1% NaCl，1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物)，30 °C温浴60-90分钟；`
8)取100-200u I菌液均匀涂布于选择性LB平板。
[0012]上述实施例所用宿主菌恶臭假单胞菌中含有CueR蛋白的编码基因，若所用宿主菌中无CueR蛋白的编码基因，则还应将含有CueR蛋白编码基因的多核苷酸序列构建入与上述表达质粒相同或相异的质粒中(或插入到宿主菌的基因组中)，使宿主菌能够产生具有生物活性的CueR蛋白。
[0013]铜离子浓度检测方法如下:
1)取转化所述质粒的恶臭假单胞菌单菌落，接种于含有30-50mg/l卡那霉素的LB液体培养基；
2)取对数期菌液(OD6tltl= 0.5-1.0)，4°C条件下3000Xg离心5分钟后弃上清，使用相同体积的含有铜离子的LB培养基重悬,30°C条件下振荡培养2小时；
3)4°C条件下3000Xg离心5分钟后弃上清，使用1/2体积的PBS (137 mM NaCl, 2.7mM KCl，10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)重悬；
4)取IOOiU菌液加入到酶标板中，使用酶标仪检测各菌液的荧光强度。
[0014]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种用于铜离子浓度检测的细菌全细胞生物传感器，以及利用所述生物传感器定量检测水溶液中铜离子浓度的方法。
2.一种镉离子诱导的荧光蛋白报告系统，其特征在于，采用基于铜特异性操纵子(启动子)多核苷酸序列(SEQ ID NO:1)及CueR蛋白(SEQ ID NO: 2)的转录调控系统调控荧光蛋白基因的转录，将铜离子浓度信号转化为荧光强度信号。
3.如权利要求2所述荧光蛋白，其特征在于，包括但不限于绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和青色荧光蛋白等。
4.一种宿主细菌，其特征在于，包含权利要求2所述的报告系统并能够正常转录及表达。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将荧光蛋白所发的荧光强度和铜离子浓度制成工作曲线，从而通过 检测荧光强度达到检测铜离子浓度的目的。
【文档编号】G01N21/64GK103627666SQ201210309671
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月28日 优先权日:2012年8月28日
【发明者】李鹏松, 陶虎春, 彭智文, 苏捷, 于太安 申请人:北京大学深圳研究生院