专利名称：一种抗体及其应用、制备方法
技术领域：
本发明涉及人白介素-23受体胞外区结构域(hIL-23R-CHR)的特异性单克隆抗体及其用途，本发明还涉及产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株9H3保藏号=CCTCCC201240。
背景技术：
免疫系统的功能在于保护个体免受细菌、多细胞有机体和病毒等感染原及癌症的损害。这种系统包括若干类型的淋巴细胞和骨髓细胞单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)、嗜酸性粒细胞、T细胞、B细胞及中性粒细胞。这些淋巴细胞和髓系细胞通常产生称为细胞因子的信号蛋白(肽)。免疫反应包括炎症，即，免疫细胞在全身或在身体特定部位积聚。当感染原或外来物质入侵时，刺激免疫细胞分泌细胞因子，细胞因子继而调节免疫细胞的增殖、发育、分化或迁移。当免疫反应涉及过量的炎症因子时，它可能产生病理后果。hIL-23 与 hIL_23R 的关系人白介素-12(hIL_12)是由p35和p40两个亚基组成的异二聚体细胞因子，主要由单核巨噬细胞(ΜΦ)和树突状细胞(DC)产生。hIL-12具有促进分化的CD4+T辅助细胞I(Thl)增殖，促进细胞毒性T细胞(CTL)的形成，提高NK细胞的细胞毒性，诱导T细胞和NK细胞产生INF-Y、TNF-a和IL-6等细胞因子，这些免疫细胞因子的过表达跟银屑病、克罗恩病(CD)、炎症性肠病(IBD)和风湿性关节炎(RA)等自身免疫疾病密切相关。而人白介素23 (hIL-23)则是近期发现的类似于hIL-12的促炎症细胞因子，属于IL-12家族，由单独的pl9亚单位和hIL-12的p40亚单位组成。hIL_23主要由活化的DCs、ΜΦ以及记忆性T细胞和NK细胞分泌。hIL-23在ThO向Thl7细胞分化的起始及维持Thl7分化、发育中起关键性作用。hIL-23能促进T细胞尤其是CD4+T细胞增殖，促进T细胞、抗原递呈细胞(APC)产生IFN- Y与IL-12，并对DC的共刺激功能起调节作用。近来的研究揭示hIL_23在银屑病、⑶、IBD和RA等自身免疫性疾病发病机制中较hIL-12处于更重要的地位。因此，hIL_23和hIL-12拮抗剂研究与开发已成为相关疾病新药创制的焦点。hIL-23的受体是由hIL_12 0 I与hIL_23R共同组成的受体复合物。除了 hIL_12R的共有亚基hIL-12Ri3 1，pl9亚基特异性受体hIL_23R是造血因子受体超家族的一个新成员。hIL-23R包含一个细胞外区域、一个单跨膜区域和一个有252个氨基酸的胞质区域。其胞外区不同于其他造血因子受体超家族成员的三个膜纤维蛋白连接，而是由一个信号序列、一个N端免疫球蛋白样结构域和2个细胞因子受体区域组成。hIL-23与hIL-12共用Jak-stat 信号分子，如 Jak2、Tyk2、STATl、STAT3、STAT4 和 STAT5，而 hIL_23R 主要是运用Jak2和STAT3信号分子。hIL-23R 与 IL-17 的关系IL-17通常指的是IL-17A，属于IL-17家族，主要由Thl7产生。Thl7是最近研究发现的一类不同于Thl和Th2的⑶4+T细胞亚群。目前Thl7的调控机制仍不十分清楚，对于Thl7分化过程的研究提出两种模型一种认为，Thl和Thl7的早期分化阶段是一致的，后期分化不同是由于hIL-12和hIL-23选择性的作用于同时表达hIL_12R/hIL_23R的“前Thl细胞”;另一个模型认为，Thl和Thl7代表的是完全不同的细胞系，从一开始的分化过程就不同。后来证实的确存在与Thl无关的Thl7分化途径。TGF-β和IL-6是Thl7分化的启动者，hIL-23是Thl7的活化和维持者。hIL-23在Thl7细胞分化过程中具体的作用机制被认为与STAT-3有关，因为hIL-23可以介导STAT-3的磷酸化过程，使STAT-3激活从而促进IL-17的分泌。故hIL-23R对Thl7细胞亚群来说是一个关键的作用因子。hIL23/hIL23R_Thl7/IL17轴在自身免疫性疾病中的致病性也已被证实。减少被鼠白介素-23(mIL-23)刺激的IL-17的产生就可以减少EAE在小鼠模型中的发生，同时运用IL-17的抗体可以提供部分的保护作用。更进一步的研究表明，重组基因mIL-23pl9能够加剧小鼠的结肠炎，相反抗mIL-23pl9抗体的治疗就能够改善EAE。因此Thl7细胞在炎症免疫性疾病中具有重要作用，可以作为一个新的药物作用靶分子。hIL_23R与自身免疫性疾病的关系研究表明，hIL_23R与由hIL-23/IL_17通路引起的炎症免疫性疾病密切相关。银屑病是一个常见的、慢性的T细胞介导的炎症性皮肤疾病。研究发现银屑病患者在皮肤损害处hIL-23pl9和p40mRNA的水平显著增高。Ann Begovich等人的相关研究亦证实hIL-23R遗传变异体与银屑病紧密相关。另外，mIL-23高表达的转基因小鼠模型进一步证实hIL-23/hIL-23R通路在银屑病病理学形成过程中发挥中轴作用。上述研究结果提示hIL-23/hIL-23R通路可能是银屑病一个重要的干预治疗靶向。强直性脊柱炎(AS)是最常见的炎症性关节炎之一。研究发现在hIL_23R基因上多个SNP与AS密切相关。Fraser Cummings JR等研究亦发现IL-23R基因上多个SNPs均跟克罗恩氏病显著相关。而Buing等人则进一步验证位于hIL-23R上的SNPrsl 1209026 (Arg381Gln)对于炎症性肠病来说是一个保护性的标志。这些研究结果表明hIL-23R/Thl7通路可能参与AS进程。近来研究中，通过P40敲除小鼠证明阻断hIL-23和hIL_12可以有效治疗许多的炎性及自身免疫性疾病。但是当通过P40亚基阻断hIL-12时会增加机体对微生物感染的敏感性。hIL-23pl9/hIL_23R在自身免疫性疾病的发病以及抗肿瘤、抗感染和移植排斥等方面发挥积极的作用。人白介素-23受体胞外区结构域(hIL-23R-CHR，GenBank CAH70406. I其中第124-313位氨基酸为目的序列)属于人白介素-23受体(hIL_23R)胞外区，是与hIL-23结合的有效功能区(Parham C，Chirica M，Timans J等(2002) JImmunol 168 (11) :5699-5708)。阻断 hIL_23R_CHR 对于阻断 hIL_23pl9/hIL_23R，治疗关节炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮、银屑病、多发性硬化或哮喘都有重要的意义，有望成为hIL-23/IL-17介导的炎性及自身免疫性疾病治疗的有效靶点。本发明单克隆抗体是针对hIL-23R-CHR，可以封闭天然的hIL_23R的功能，进而可以防治由hIL23/hIL23R_Thl7/IL17轴介导的炎性及自身免疫性疾病。
发明内容
一种抗体，其特征在于其包括氨基酸序列具有SEQ ID NO :7_12中任意一种以上所示的序列或其变异体、同源物或衍生物。
所述的抗体包括重链可变结构域Vh和轻链可变结构域 '，其中c)重链可变结构域Vh依次包含高变区⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3，所述⑶RHl的氨基酸序列为SEQ ID NO 7 ;所述CDRH2的氨基酸序列为SEQ ID NO 8 ;所述CDRH3的氨基酸序列为 SEQ ID NO 9 ；d)轻链可变结构域Vl依次包含高变区⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3，所述⑶RLl的氨基酸序列为SEQ ID NO 10 ;所述CDRL2的氨基酸序列为SEQ ID NO 1 ;所述CDRL3的氨基酸序列为 SEQ ID NO 12o所述的抗体为小鼠杂交瘤细胞株9Η3保藏号为CCTCC NO C201240产生单克隆抗体，其抗体氨基酸序列为SEQ ID NO 130上述任意一种抗体在治疗由hIL-23介导的炎性或免疫性疾病药物中的应用。所述的免疫性疾病为关节炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮、银屑病、多发性硬化或哮喘。所述的关节炎是类风湿性关节炎。所述的炎性肠病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。上述的抗体用于hIL_23R的检测方法，其特征在于检测方法中应用标记物结合的单克隆抗体，其中标记物包括酶标记物、突光标记物、胶体金标记物或放射性标记物。保藏信息杂交瘤细胞株9H3，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号=CCTCC NO :C201240，保藏时间为2012年3月29日。注本发明涉及杂交瘤细胞株9H3，系细胞株，无分类名和拉丁名。有益效果本发明获得一株稳定分泌抗hIL-23R_CHR特异性抗体的杂交瘤细胞株9H3 (保藏编号CCTCC C201240)，其分泌的单克隆抗体明显抑制Thl7分化免疫排斥模型中IL-17A的分泌，并体内实验显示该单抗可以有效改善EAE小鼠、胶原诱发关节炎(CIA)小鼠及IBD样HLA-B27大鼠症状的严重程度。体内体外实验显示，该单抗是治疗hIL23/hIL23R-Thl7/IL17轴介导的炎性及自身免疫性疾病的潜在药物。
图I为单抗9H3SDS-PAGE分析。其中，泳道I为辛酸-硫酸铵沉淀单克隆抗体，泳道2为S印horose-200柱纯化单克隆抗体。图2为单抗9H3Western的结果。图3为单抗9H3酶结合物S印hadex G200柱(2. 6cmX 100cm)层析洗脱曲线。图4为单抗9H3细胞ELISA的结果。图5为hIL-23刺激对脾淋巴细胞IL-17A分泌的影响。图6为单抗9H3对hIL_23刺激脾淋巴细胞IL-17A分泌的影响。图7为单抗9H3组与对照组EAE小鼠临床评分。图8为单抗9H3组与对照组HLA-B27大鼠临床评分。图9为单抗9H3组与对照组CIA小鼠临床评分。图10为单抗可变结构域测序报告。其中，第47-379位为单抗9H3重链可变结构域核苷酸序列；第425-757位为单抗9H3轻链可变结构域核苷酸序列。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备单克隆抗体及其制备方法的简单改造，都属于本发明要求保护的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、动物免疫hIL-23R-CHR蛋白(抗原制备方法及鉴定参照发明专利重组质粒pET32a-hIL-23R-CHR及其构建表达，专利申请号号:201110096271. 8，申请日期2011. 04. 18 ;核酸序列为SEQ ID NO 1 ;氨基酸序列为SEQ ID NO :2)，溶于生理盐水，与弗氏完全佐剂等体积混合，经充分乳化后，接种于BALB/c小鼠(扬州大学比较医学中心提供，SCXK (苏)2007-0001)腹腔，10 μ ghIL_23R_CHR蛋白/200 μ L/只；于基础免疫后，间隔两周采用相同的抗原剂量与等体积弗氏不完全佐剂混合，进行加强免疫；于第二次加强免疫后一周，以间接ELISA法测定免疫小鼠抗血清效价。以正常鼠血清为阴性对照，以(测定孔A值-空白值)/(阴性对照孔A值-空白值)>2. I为判定标准，进行测定。小鼠抗血清终点效价均为I : 12，8000以上。选择血清hIL-23R_CHR特异性抗体效价最高的小鼠用于细胞融合，并于融合前3天，腹腔接种20 μ ghIL-23R-CHR蛋白进行冲击免疫。实施例2、单克隆抗体的制备I.细胞融合细胞融合采用聚乙二醇法无菌操作取如实施例I所述免疫的小鼠脾脏，制成细胞悬液，离心，细胞计数；将I X IO8脾细胞与2X107SP2/0细胞混合，IOOOrpm离心IOmin,弃上清液，将离心管置于37°C水浴中；取Iml预热至40°C的50% PEG缓慢滴加到细胞沉淀上，以基础培养基悬浮细胞；IOOOrpm离心lOmin，弃上清液，加HAT培养基重悬细胞，分装于96孔细胞培养板，将培养板置于37°C、5%的CO2湿润细胞培养箱中培养，5天后用新鲜HAT换出培养板孔中1/2培养基，10天后用HT培养基换出HAT。2.融合细胞的筛选及克隆化培养采用有限稀释法克隆化杂交瘤细胞以hIL-23R_CHR蛋白作为筛选包被抗原，山羊抗小鼠IgM-HRP/IgG-HRP作为检测抗体。阳性孔杂交瘤细胞经亚克隆一筛选一亚克隆一筛选一亚克隆一扩大培养。具体的，用小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后，接种于96孔细胞板HAT选择性培养基上。经三次亚克隆，建立了稳定分泌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为9H3，所分泌的单克隆抗体命名为9H3。本发明人于2012年3月29日将所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，武汉大学)，其保藏号分别为CCTCC NO :C201240。3.单克隆抗体的生产及纯化取10周龄雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射O. 5ml降植烷；一周后接种如上所述处于对数生长期的杂交瘤细胞5 X IO5个/只；7-10天后采集腹水,5000rpm离心15min,收集上清液；腹水经二氧化硅预处理后，以辛酸-硫酸铵沉淀法沉淀免疫球蛋白，最后通过Sephorose-200柱层析，获得纯化单抗，采用SDS-PAGE鉴定单抗纯度。结果见附图1，说明该纯化方法对腹水中单抗的纯化效果很好。该单克隆抗体送至南京思普金生物科技有限公司测序，结果见图10.该单克隆抗体命名为单克隆抗体9H3，其氨基酸序列为SEQ ID NO 13 ；其中该单抗重链可变结构域Vh核苷酸序列为SEQ ID NO :3，氨基酸序列为SEQ ID N0:4，重链可变结构域Vh依次包含高变区⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3，所述⑶RHl的氨基酸序列为SEQID NO 7 ;所述CDRH2的氨基酸序列为SEQ ID NO 8 ;所述CDRH3的氨基酸序列SEQ ID NO 9。轻链可变结构域'核苷酸序列为SEQ ID NO :5，氨基酸序列为SEQ ID NO :6，轻链可变结构域\依次包含高变区CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述CDRLl的氨基酸序列为SEQ ID NO 10 ;所述CDRL2的氨基酸序列为SEQ ID NO 11 ;所述CDRL3的氨基酸序列SEQ IDNO :12。实施例3、单克隆抗体的特性鉴定I.抗体亚类的鉴定采用小鼠单克隆抗体独特型分型试剂盒(IS02-1KT, sigma-aIdrich)鉴定单克隆抗体的亚类。结果杂交瘤细胞株9H3CCTCC C201240分泌的单克隆抗体的重链为IgG1，轻链为Kappa型。2.单克隆抗体亲和力测定采用间接ELISA法测定单抗亲和常数。测定实施例2中所获得纯化的单抗蛋白浓度，取一定浓度的纯化被检单抗，按间接ELISA法测定。结果9H3的亲和常数为I. 03 X IO9 · 亲和力较高。3. Western杂交检测抗体特异性hIL-23R-CHR 与 5XSDS 上样缓冲液混匀，100°C煮沸 3_5min，进行 SDS-PAGE 电泳。电泳后取下胶，裁剪合适的PVDF膜和滤纸。常温转膜1.5h。转膜后用3% BSA封闭2h。用纯化的单克隆抗体孵育过夜。次日用O. 05% Tween-TBS清洗，加HRP标记的山羊抗小鼠二抗，随后用ECL显色。如图2所示，单克隆抗体9H3与hIL-23R_CHR蛋白呈特异性显色。实施例4、酶标抗体的制备参照刘秀梵主编，单克隆抗体在农业上的应用，第一版，安徽科学技术出版社，1994,61-62中所述方法，对腹水单抗9H3进行辣根过氧化物酶(HRP)标记；将标记物经Sephadex G200凝胶层析纯化,分部收集,合并第一峰。Sephadex G200凝胶层析结果见图3，酶标单抗质量鉴定结果见表I。表I单抗9H3的辣根过氧化物酶标记物(9H3-HRP)的质量鉴定
权利要求
1.一种抗体，其特征在于其包括氨基酸序列具有SEQ ID NO :7-12中任意一种以上所示的序列或其变异体、同源物或衍生物。
2.根据权利要求I所述的抗体，其特征在于所述的抗体包括重链可变结构域Vh和轻链可变结构域'，其中 a)重链可变结构域Vh依次包含高变区⑶RH1XDRH2和⑶RH3，所述⑶RHl的氨基酸序列为SEQ ID NO 7 ;所述CDRH2的氨基酸序列为SEQ ID NO 8 ;所述CDRH3的氨基酸序列为SEQ ID NO 9 ； b)轻链可变结构域Vl依次包含高变区⑶RL1XDRL2和⑶RL3，所述⑶RLl的氨基酸序列为SEQ ID NO 10 ;所述0)1^2的氨基酸序列为SEQ ID NO 11 ;所述0)1^3的氨基酸序列为 SEQ ID NO 12o
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于所述的抗体为小鼠杂交瘤细胞株9Η3保藏号为CCTCC NO C201240产生单克隆抗体，其抗体氨基酸序列为SEQ ID NO :13。
4.一种制备权利要求1-3任意一种抗体在治疗由hIL-23介导的炎性或免疫性疾病药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征所述的免疫性疾病为关节炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮、银屑病、多发性硬化或哮喘。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的关节炎是类风湿性关节炎。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的炎性肠病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
8.根据权利要求1-3所述的抗体用于hIL-23R的检测方法，其特征在于检测方法中应用标记物结合的单克隆抗体，其中标记物包括酶标记物、突光标记物、胶体金标记物或放射性标记物。
全文摘要
本发明涉及一种人白介素-23受体胞外区结构域(hIL-23R-CHR)特异性单克隆抗体。本发明还涉及产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株(保藏号CCTCC NOC201240)和单克隆抗体的制备方法。本发明另外还涉及hIL-23R-CHR单克隆抗体在治疗炎性及免疫性疾病中的用途，所述炎性及免疫性疾病的特征是存在升高水平的hIL-17。
文档编号G01N33/577GK102924599SQ20121034780
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年4月19日
发明者高向东, 赵虎, 贾国栋, 姚文兵, 郭薇 申请人:中国药科大学