专利名称：血小板聚集功能检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及血小板检测领域，具体地，涉血小板聚集功能检测试剂盒，以及利用所述试剂盒检测血小板聚集功能的方法。
背景技术：
血小板在生理性止血、维持血管壁完整性以及某些病理过程，如血栓形成、动脉粥样硬化、不稳定性心绞痛、肿瘤转移和炎症反应等过程中起着重要作用。大量研究表明，血小板的激活和聚集是体内血栓形成的始动因素，亦是血栓形成过程中最关键的成份之一。 临床常见的危重急症如心性猝死、心肌梗死、脑卒中、肺梗死等均是血栓性疾病。因此，血小板功能检测对早期发现血栓风险以及血小板相关疾病的诊断和治疗有着重要的意义。
临床研究结果亦证实，应用阿司匹林、抵克力得、氯吡格雷、血小板糖蛋白IIb/ IIIa受体拮抗剂(GPI)等抗血小板药物可显著减少动脉粥样硬化血栓风险，故抗血小板治疗在心脑血管病一级、二级预防中得到广泛应用，并取得了良好的效果。
但是，由于心脑血管疾病的临床情况复杂多样，标准抗血小板治疗方案并不适用于所有病人。部分病人即使接受了常规剂量抗血小板药物的治疗，仍然发生血栓事件，即患者对抗血小板治疗反应性不佳，临床将其称为“抗血小板药物抵抗”现象。临床治疗中，抗血小板药物抵抗的发生率约109Γ50%，后果较为严重，此类病人的主要心脑血管缺血事件(死亡、心肌梗死或卒中)的风险约为非抵抗病人的3-5倍。因此，早期识别并妥善处理抗血小板药物抵抗可在很大程度上改善心脑血管疾病患者的预后。国内外文献报道，血小板功能检测与临床血栓事件之间有很好的相关性，通过血小板聚集功能检测，可以获知病人对抗血小板治疗的反应性、预测病人的血栓风险,从而可有针对性地采取个体化抗血小板治疗, 减少血栓事件并发症。
目前临床上常用的能够量化检测血小板功能的方法主要有光学比浊法，孔隙封闭时间法，血小板计数法、血小板诱导聚集比浊法及血栓弹力图方法，分述如下
I、光学比浊法测定血小板聚集率(LTA)是最经典的血小板功能检测方法，常作为诊断研究用的金标准，与临床事件的相关性很好。具体方法首先分离富含血小板血浆，加入激活物后促进血小板与血小板之间的聚合，再以贫血小板血浆作为对照测定样品的透光度，如果血小板聚集，则透光度降低。LTA方法的特点是可以采用特异性激活物，从而检测不同抗血小板药物的效果，如采用花生四烯酸诱导的血小板聚集率可反映机体对阿司匹林治疗的反应性，采用ADP作为诱导剂则主要反映对氯吡格雷(或其他噻吩并吡啶类药物)治疗的反应性。其主要缺点包括血样处理要求在短时间内完成、重复检测变异较大、采血量相对较大、需分离富含血小板血浆因而样品处理时间较长等。
2、孔隙封闭时间法PFA-100系统最早在1995年由Kundu等提出，对抗凝全血的血小板功能进行定量检测。PFA-100模仿体内血管损伤时的止血环境，此系统由微处理器控制，使用一次性反应杯，内有一层生物膜，表面附有胶原，并含有ADP或肾上腺素。当用枸橼酸钠抗凝的全血从膜的小孔中抽吸出来时，血小板粘附于胶原并被ADP或肾上腺素进一步活化，形成血小板栓子将小孔阻塞，仪器自动记录小孔完全阻塞的时间，所需的时间称为 “封闭时间”。胶原和ADP用来区分先天和后天性血小板功能障碍，胶原和肾上腺素都适合检测阿斯匹林诱导的正常人血小板异常。PFA-100操作简单，结果准确，临床上用于vWD和血小板异常的筛选，以及抗血小板药物治疗的监测和外科手术过程中初级止血的评价。然而PFA-100对于纤维蛋白原缺陷疾病的诊断的灵敏度低。
3、血小板计数法Plateletworks由美国Helena公司研发。其机理类似于血小板计数仪。将全血分别置入混有EDTA抗凝(基础对照)或血小板激活剂(胶原、花生四烯酸、 ADP)的试管中，5分钟后分别进行血小板计数，比较不同激活剂处理的试管和基础对照试管中的血小板计数,即可计算血小板聚集率(PAG)。PAG=(原始血小板数-聚集后血小板数)/ 原始血小板数X 100%。Plateletworks的优点是采用全血标本,操作简便、快速,但缺点是无法监测阿司匹林对血小板功能的抑制效果，而且与临床血栓事件的相关性不佳。
4、血小板诱导聚集比池法VerifyNow由美国Accumetrics公司研发,2006年经美国FDA批准用于血小板功能检测。其原理是在试管内预混有血小板激活剂和纤维蛋白原包被的小珠。加入全血标本后后，血小板受激活剂作用而活化，其表面Ilb/IIIa受体复合物与小珠表面的纤维蛋白原交联，使血小板聚集于小珠表面，试管内透光性增强。VerifyNow 属床旁检测设备，可分别以花生四烯酸、ADP及凝血酶受体激活肽(TRAP)作为激动剂，特异性地检测血小板对阿司匹林、P2Y12阻滞剂及GPI的反应性。VerifyNow技术的优势是采用全血作为标本，整个检测过程仅需3分钟，在目前所有血小板功能检测方法中耗时最短。迄今为止，已有上百篇正式发表的文献报道采用VerifyNow检测血小板聚集功能，但此方法仅是检测血小板聚集的最初阶段，且检测费用较高，短期内难于推广。
5、血栓弹性图(TEG)方法德国Helmut Hartert教授在上世纪40年代研制出相应的仪器，其原理是体外模拟缓慢静脉血流，用传感器测定血栓形成的时间和强度，并由计算机绘制出血凝强度曲线。将一导丝相连的探针置入全血标本中，装有全血样本的容器以一定的角度顺逆时间交互转动，血栓形成后，粘合于探针表面，并与之一起转动，血栓强度越大，则探针运动幅度越大，通过与探针相连的细丝将探针的运动幅度记录下来，即可判断血液凝结的速度和强度，进而判断血栓风险的大小。TEG的优点是采用全血检测，除检测血小板功能外，还可了解血栓溶解的情况，对血栓和出血风险均可进行评价。
美国希莫斯科普公司在TEG方法的基础上研制出监测血小板抑制的方案(专利申请号CN 200480012116.1)。在枸橼酸钠、肝素、水蛭素存在的环境下，采用蛇毒凝血酶 (batroxabin)代替人凝血酶,使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，并加入ADP等激活剂激活血小板，测定最大血凝块强度。活化凝血XIII因子作为一种激活剂仅仅在具体实施例一种备选方案中被提及，并非必需物料。该技术存在的缺点为准确性及稳定性较低。发明内容
本发明的目的之一是针对现有技术的不足，提供血小板聚集功能检测试剂盒，可用于评估临床上各种抗血小板药物的治疗效果。
本发明的另一目的是提供利用所述试剂盒检测血小板聚集功能的方法。
本发明所述的血小板聚集功能检测试剂盒，主要包括以下检测试剂枸橼酸钠全血激活剂，纤维蛋白激活剂和血小板激活剂。5
所述纤维蛋白激活剂，含有重组巴曲酶(RecombinantBatroxobin)和活化凝血因子(Activated Coagulation Factor)。
所述重组巴曲酶作用是将纤维蛋白原转变为纤维蛋白，它通过基因重组的方式在酵母体内制备。
其中，所述活化凝血因子至少含有活化凝血因子V，VIII，X，XIIIa中的一种。它们通过基因重组的方式制备或从人血浆中提取，体外激活并进行纯化。所述枸橼酸钠全血激活剂，含有高岭土和氯化钙(CaCl2),用于激活枸橼酸钠抗凝全血。
所述血小板激活剂为花生四烯酸(AA)或其钠盐、钾盐，二磷酸腺苷(ADP)或其钠盐、钾盐，凝血酶受体激活肽(TRAP)，肾上腺素或胶原等。
其中，将所述枸橼酸钠全血激活剂充分溶解于枸橼酸钠抗凝全血后，其中高岭土在该全血中的终浓度为flOmg/L ;CaCl2溶液在该全血中的终浓度为2 40mmol/L，优选 2 15mmol/L。
其中，将所述纤维蛋白激活剂充分溶解于肝素抗凝全血后，重组巴曲酶在该全血中的终浓度为2 15μ8/ιΛ，优选KTlSyg/mL;活化凝血因子在该全血中的终浓度为 8 50 μ g/mL,优选 8 10 μ g/mL。
所述纤维蛋白激活剂，还含有酶稳定剂、塑型剂及防腐剂。
其中，所述酶稳定剂为牛血清白蛋白(BSA)。它在溶于肝素抗凝全血中的终浓度为 O. 2% 4. 6% (w/v)，优选 O. 3% 0· 6%ο
其中，所述塑型剂为乳糖或/和蔗糖。它们在溶于肝素抗凝全血中的终浓度均为 O. 5% 2. 2% (w/v)，优选 O. 5% O. 8%ο
其中，所述防腐剂为叠氮化钠。它在肝素抗凝全血中的终浓度为O. 059Γ0. 20%(w/ V)，优选 O. 05% 0· 07%。
其中，所述花生四烯酸或其钠盐、钾盐溶于肝素抗凝全血中的终浓度为O. 5^1. Ommol/L, 二磷酸腺苷或其钠盐、钾盐溶于肝素抗凝全血中的终浓度为 5. (Γ7. 5 μ mol/L。凝血酶受体激活肽、肾上腺素、胶原溶于肝素抗凝全血中的终浓度均为0.3 1. 8mg/L。
本发明所述的血小板聚集功能的检测试剂盒，还包括单独装有所述枸橼酸钠全血激活剂的测定杯，单独装有纤维蛋白激活剂的测定杯，装有纤维蛋白激活剂和血小板激活剂的测定杯，以及分隔并合并包装这些测定杯的包装盒。
上述检测试剂均为单杯单人份测试包装，为了区分各试剂的不同功能和用途，采用测定杯以不同颜色分装以示区别。
本发明所述试剂盒，各检测试剂均冻干于测定杯杯底后进行包装。
本发明提供的试剂盒，通过检测血小板的聚集功能，评估各种抗血小板药物的临床药效，是通过检测抗血小板药物的抑制效果(抑制率)实现的。
即本发明还提供了所述试剂盒在评估抗血小板药物临床疗效中的应用。
其中，所述抗血小板药物，具体为阿司匹林(Aspirin)、噻吩并吡啶类药物、阿昔单抗(Abciximab)、GKWEWGGPK 九妝、酌·妥拉明(Phentolamine)或普萘洛尔(Propranolol)等。
进一步地，所述噻吩并卩比唳类药物为氯卩比格雷(Clopidogrel )、抵克力得(Ticlopidine)、普拉格雷(Prasugrel)或替卡格雷(Ticagrelor)。
本发明提供的试剂盒利用测定血液粘度的方法进行血小板聚集功能的检测，通过加入过量的血小板激活剂，对血小板相应膜受体通道进行激活(不同的激活剂对应不同血小板膜受体通道，如花生四烯酸对应A2膜受体通道激活，而阿司匹林专门抑制此通道)，对照血小板全激活状态下(通常为凝血酶激活)的血块强度，可得出各类抗血小板药物的抑制效果(通常以百分数表示)。
具体的原理如下在肝素抗凝环境下，凝血酶和其他凝血因子活性均被抑制，通过纤维蛋白激活剂中的重组巴曲酶激活纤维蛋白原，然后在活化凝血因子作用下使纤维蛋白单体交联成结实的网状结构。在此过程中，血小板未被激活，测定的血块强度仅有纤维蛋白的贡献。
当血小板激活剂加入时，相应膜受体通道被激活，此时测定的血块强度便含有纤维蛋白和血小板两者的贡献。两者相减的值即是血小板单独的贡献。当使用某些对应的抗血小板药物时(如阿司匹林可抑制A2受体通道的激活，氯吡格雷或其他噻吩并吡啶类药物可抑制ADP受体通道的激活)，血小板对于血块强度的贡献便下降。衡量其下降的幅度便是药物的抑制率。通常，以血小板完全被激活时测得的血小板在血块强度中的贡献为无药物抑制的基准。在实际操作中，这一基准是通过枸橼酸钠全血激活剂来完成测试的。抑制率的计算公式如下
其中MAx为肝素抗凝全血加入本发明纤维蛋白激活剂和血小板激活剂后测得的血块强度，MAff为肝素抗凝全血只加入纤维蛋白激活剂测得的血块强度，两者相减即为在抗血小板药物作用下，血小板在血块强度中的贡献值;MA,6为枸橼酸钠抗凝全血加入枸橼酸钠全血激活剂测得的血块强度，减去MA纟〒即为无药物抑制下血小板在血块强度中的贡献值。 一般而言，MA纤、MAX、MA总的曲线开口幅度依次由小变大。
权利要求
1.一种血小板聚集功能检测试剂盒，主要包括以下检测试剂枸橼酸钠全血激活剂，纤维蛋白激活剂和血小板激活剂；所述纤维蛋白激活剂中含有重组巴曲酶和活化凝血因子。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述活化凝血因子选自活化凝血因子V，VIII，X，XIIIa中的一种或几种。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于，所述枸橼酸钠全血激活剂中含有闻岭土和氣化隹丐。
4.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于，所述血小板激活剂为花生四烯酸或其钠盐、钾盐，二磷酸腺苷或其钠盐、钾盐，凝血酶受体激活肽，肾上腺素或胶原。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，将所述枸橼酸钠全血激活剂溶解于枸橼酸钠抗凝全血后，其中高岭土在该全血中的终浓度为f 10mg/L，氯化钙在该全血中的终浓度为2 40mmol/L。
6.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于，将所述纤维蛋白激活剂溶解于肝素抗凝全血后，其中重组巴曲酶在该全血中的终浓度为2 15μ g/mL，活化凝血因子在该全血中的终浓度为8 SOyg/mL。
7.根据权利要求1、2或6所述的试剂盒，其特征在于，所述纤维蛋白激活剂还含有酶稳定剂、塑型剂及防腐剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述酶稳定剂为牛血清白蛋白，它溶于肝素抗凝全血中的终浓度为O. 29Γ4. 6% ;所述塑型剂为乳糖或/和蔗糖，它们溶于肝素抗凝全血中的终浓度均为O. 59Γ2. 2% ;所述防腐剂为叠氮化钠，它溶于肝素抗凝全血中的终浓度为 O. 05% 0· 20%ο
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述花生四烯酸或其钠盐、钾盐溶于肝素抗凝全血中的终浓度为O. 5^1. Ommol/L，二磷酸腺苷或其钠盐、钾盐溶于肝素抗凝全血中的终浓度为5. (Γ7. 5 μ mol/L，凝血酶受体激活肽、肾上腺素、胶原溶于肝素抗凝全血中的终浓度均为O. 3^1. 8mg/L。
10.根据权利要求I、任意一项所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括装有所述枸橼酸钠全血激活剂的测定杯，装有纤维蛋白激活剂的测定杯，装有纤维蛋白激活剂和血小板激活剂的测定杯，以及分隔并合并包装这些测定杯的包装盒；所述测定杯以不同颜色区分，各检测试剂均冻干于测定杯杯底后进行包装。
11.权利要求f10任意一项所述的检测试剂盒在评估抗血小板药物临床疗效中的应用。
12.利用权利要求10所述的试剂盒检测血小板聚集功能的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)采集枸橼酸钠抗凝全血及肝素抗凝全血，两种全血中均含有抗血小板药物； (2)将枸橼酸钠抗凝全血注入含有枸橼酸钠全血激活剂的测定杯中，测定血块强度MA总； (3)将肝素抗凝全血注入含有纤维蛋白激活剂的测定杯中，测定血块强度MAff； (4)将肝素抗凝全血注入含有纤维蛋白激活剂和血小板激活剂的测定杯中，测定血块强度MAx ；(5)根据如下公式计算出抗血小板药物的抑制率
全文摘要
本发明涉及血小板聚集功能检测试剂盒，以及利用所述试剂盒检测血小板聚集功能的方法。所述检测试剂盒主要包括以下检测试剂枸橼酸钠全血激活剂，纤维蛋白激活剂和血小板激活剂；所述纤维蛋白激活剂中含有重组巴曲酶和活化凝血因子。使用本发明的试剂盒进行检测，血样处理要求低，重复检测变异性小，准确性和稳定性高，方便使用和储存，检测成本低，易于推广。
文档编号G01N33/15GK102980993SQ201210440139
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者周高英 申请人:北京乐普医疗科技有限责任公司