技术领域
本发明涉及脂筏修饰的色谱柱，特别涉及脂筏-硅胶色谱在中药抗肿瘤活性部位在线筛选中的应用。
背景技术：
21世纪以来，以受体为靶标的药物筛选技术[SchreiberSL.Science.2000，287：1964-1969.DrewsJ.Science.2000，287：1960-1964]及计算机辅助药物设计的虚拟筛选技术成为发现药物先导物的有效方法。随着肿瘤发病机制的不断阐明和抗肿瘤作用靶点的不断发现，多靶点抑制肿瘤信号转导成为肿瘤药物开发的重要方向。在各种分子靶点中，受体蛋白酪氨酸激酶(receptorprotein-tyrosinekinase，PTK)是目前效果明显且前景广阔的抗肿瘤药物靶点之一[李欣，高金恒，陈国良.沈阳药科大学学报.2011，28(12)：938-1012]。PTK是一组催化蛋白质酪氨酸残基磷酸化的酶系，其在细胞内的信号转导中起着十分重要的作用，与肿瘤细胞的生长、增殖、分化和凋亡密切相关。通过抑制PTK可破坏肿瘤细胞的信号传递，抑制肿瘤细胞增殖，从而达到抗肿瘤的目的[MendelsohnJ.ClinCancerRes.1997，3(12)：2703-2707]。通过干预受体酪氨酸激酶信号转导进行肿瘤治疗，已成为肿瘤治疗研究和抗肿瘤药物筛选的一个新的靶点。近年来科学家在酪氨酸蛋白激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors，TKI)这一领域进行了大量的工作，合成了数百个受体型或者非受体型酪氨酸激酶抑制剂，其中8个小分子抑制剂已被美国食品药品管理局(FDA)批准作为抗肿瘤药物进入临床使用[王勇，龙亚秋.有机化学，2011，31(10)1595]。
TrKA是PTK家族成员之一，它是分子量为140kDa的酪氨酸蛋白激酶受体。它也是一种跨膜蛋白，由790个氨基酸构成，分为三个部分，即胞外部，跨膜部和胞质部。胞外部含有8个亮氨酸的重复区域，其前后分别串联着一组半胱氨酸残基，紧挨细胞膜的是被称之为C2的免疫球蛋白(IgG-C2)恒定区；胞质部分有酩氨酸激酶。已有的研究证明，活化的TrkA在人脑胶质瘤细胞系U251、胃癌细胞系(gastriccarcinoma，SGC-7901)等细胞中高表达。
许多TrKA都集中在细胞膜的脂筏区[Hanzal-BayerMF，HancockJF.FEBSLett.2007；581：2098-2104]。脂筏(lipidraft)是细胞膜双层结构内含有特殊脂质和特殊蛋白质的微区域。脂筏和细胞的许多功能，如信号转导、蛋白质和脂类的转运等都相关，随着脂筏作为细胞膜上信号传导的平台的认识，这个特征化的区域受到了越来越多的关注。研究表明，脂筏对影响肿瘤发生、发展、侵袭的信号转导通路以及凋亡信号通路等多种因素均具有调节作用，因而成为近年来肿瘤治疗研究中的新热点[吴瑛，刘云鹏。癌症进展杂志。2007，11(5)：572-575]。
应用受体为靶标进行药物筛选时，需要配套大容量的单一化合物库，以保证化合物结构的多样性，难以应用于复杂体系的直接筛选。中药及其有效成分是近年来肿瘤治疗研究的热点之一，在肿瘤治疗中的多靶点效应正在得到广泛的认可。中药是各种成分的混合物，其有效成分定量不明确、个体反应差异较大，传统的整体动物模型和离体器官试验虽然能够筛选其有效组分，但是如果要大规模筛选，工作量十分庞大、研究周期长、花费高、效率低[陈晓萌，陈畅，李德风，杨洪军，许海玉.中国实验方剂学杂志.2011，17(12)：249-252]。
脂筏色谱法(lipidraftchromatography，LRC)是本发明构建的研究脂筏中富含的酪氨酸蛋白激酶受体与药物相互作用的新型亲和色谱技术。该技术将高效液相色谱、分子生物学与受体药理学相结合，利用药物与酪氨酸蛋白激酶受体间的特异性亲和力，使得中药提取物中的抗肿瘤活性成分在色谱柱内得到特异性保留，从而实现在线、快速、有效地对中药的抗肿瘤活性部位筛选。该技术克服了以往中药活性成分离线筛选低效、耗时的缺点，将为高通量筛选中药中的新型酪氨酸蛋白激酶抑制剂开辟道路。迄今未见基于脂筏色谱的中药抗肿瘤活性部位在线筛选模型的构建方法及其应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种脂筏修饰的硅胶色谱柱及其制法和在中药抗肿瘤活性部位在线筛选中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种以脂筏修饰的硅胶色谱柱，它是表面修饰有脂筏的硅胶色谱柱。
上述的色谱柱，所述的脂筏是TrkA脂筏。
一种制备上述以脂筏修饰的砖胶色谱柱的方法，它包括以下步骤：
步骤1.U251细胞的培养及扩增
用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养和扩增U251细胞，调整细胞数浓度为1×107～10×107个/ml，备用；
步骤2.脂筏的制备
收集步骤1所得的U251细胞，以非离子型去污剂TritonX-100抽提脂筏组分，蔗糖密度梯度离心法离心收集，将脂筏-蔗糖混悬液置4℃，pH7.2～7.5的80-120mMTris-HCL溶液中透析20～26h，合并透析液共9ml备用；
鉴定：以兔抗NGF(H-20)多抗为一抗，荧光FITC标记的羊抗兔IgG抗体为二抗进行间接免疫荧光实验，置荧光倒置显微镜下观察，观察到提取物上发出特异性的明亮绿色荧光，说明该方法可制得富含TrkA的脂筏；实验结果见图1A。
步骤3.脂筏修饰的层析砖胶的制备
将层析硅胶小球混悬于盐酸溶液中，超声处理10～20min；搅拌下同流1～3h；蒸馏水洗涤，重复操作2-4次；抽干，于110～120℃活化5～8h，作为硅胶载体备用；取步骤2所述的9ml含有脂筏的Tris-HCL溶液加入3～5g活化处理后的硅胶中，置2～6℃，恒温振摇20～26h；22～28℃静置1～3h；加入pH7.2～7.5的100mMTris-HCL15～25ml，混匀后静置3～8min；2～6℃500rpm离心8～12min，弃去上清，加入PBS，混匀后放置3～8min；重复三次；得到表面修饰有脂筏的硅胶的混悬液，该悬浊液可填充2-5支色谱柱；
鉴定：用上述间接免疫荧光法对富含TrkA的脂筏固定相进行鉴定。实验结果见图1B，所有的砖胶微球表面特异性的绿色荧光均一，鲜亮，免疫荧光实验结果表明TrkA脂筏在硅胶载体表面均匀附着，证明TrkA脂筏成功连接在层析砖胶上。
步骤4.以步骤3得到的表面修饰有脂筏的砖胶的混悬液为填料湿法装柱，即得以脂筏修饰的硅胶色谱柱。
脂筏修饰的硅胶在低压装柱前后及连续使用30天后的特异性免疫荧光无明显变化(图2)，说明装柱及使用过程对固定相脂筏修饰的砖胶无显著性影响，脂筏修饰的硅胶固定相稳定性好。
经不同流动相(A：10mM乙酸铵，pH7.4；B：2％胆酸钠+10mM乙酸铵，pH7.4；C：100μM胆固醇+2％胆酸钠+10mM乙酸铵，pH7.4；D：40μM卵磷脂+2％胆酸钠+10mM乙酸铵，pH7.4；E：40μM卵磷脂+100μM胆固醇+2％胆酸钠+10mM乙酸铵，pH7.4)处理后的脂筏-硅胶固定相特异性免疫荧光显著(图3)，说明TrkA脂筏-砖胶固定相在上述5种流动相中均具有良好的稳定性和耐用性。
脂筏-砖胶固定相的色谱性能考察
以富含TrkA脂筏-砖胶为填料制备色谱柱(30～100mm×4.6mmI.D.)，溶剂：pH7.2～7.5的100mMTris-HCL，湿法装柱；色谱条件：柱温20～37℃，流速0.1～0.3ml/min，进样量10-20μL，检测波长200～600nm，流动相为10mM的乙酸铵(pH7.2-7.4)，固定相粒径5～50μm。
选择不同固定相填料的色谱柱(纯硅胶固定相或TrkA脂筏修饰的硅胶固定相)，对特异性酪氨酸激酶(TrkA)抑制剂来他替尼(Lestaurtinib)进行分离，比较不同固定相，来他替尼在纯砖胶固定相上无明显保留，而在TrkA脂筏修饰的砖胶色谱上保留时间为34min。另选择非TrKa靶点抗肿瘤药物吉西他宾(Gemcitabine)和TrKa靶点抗肿瘤药物吉非替尼(Gefitinib)，用TrkA脂筏修饰的砖胶色谱柱进行分离，评价TrKa脂筏修饰的砖胶固定相的特异性亲合能力。实验结果见图4，容量因子的计算见表1。TrkA脂筏修饰的硅胶色谱固定相能与酪氨酸激酶受体为靶点的药物特异性结合产生保留，而非酪氨酸激酶靶点药物在该TrkA脂筏修饰的砖胶色谱柱中无保留行为。脂筏修饰的砖胶色谱柱的重现性以来他替尼为例，测定其间隔2个月前后TrkA脂筏修饰的硅胶固定相的容量因子。结果2个月之前平均值为8.32±0.58(n＝5)；2个月后容量因子的平均值为6.72±0.41(n＝5)。说明柱子重现性较好。
表1不同抗肿瘤药在不同固定相上的保留特性(±SD，n＝5)
*：2个月之后
MTT细胞毒性试验
MTT法检测待测组份的抗肿瘤活性，同时分别以低浓度的特异性酪氨酸激酶抑制剂K252A以及TrkA的一抗为信号阻断剂饱和TrkA进行对照，比较中药提取物及不同的抗肿瘤药物对TrkA的特异性抑制。试验分为样品组(细胞培养24h后即加入不同浓度的样品)，K252A组(细胞培养24h后加入200nmol/L的K252A，继续培养24h后，加入不同浓度的样品)及TrkA一抗组(细胞培养24h后加入1∶100的TrkA一抗，继续培养24h后，加入不同浓度的样品)。实验结果(图5)可见：脂筏修饰的硅胶色谱筛选出的具有明显保留行为的中药提取物与特异性TrkA抑制剂来他替尼一样，在TrkA信号阻断前后对U251细胞的抑制率有显著性差异，而氟尿嘧啶并非以TrkA作为靶点，所以在TrkA信号阻断前后均体现出良好的肿瘤细胞抑制效果。结果提示本实验所建立的脂筏修饰的硅胶色谱柱具有良好的TrkA选择性。
本发明以五倍子、葶苈子、香加皮等中药及天然产物为研究对象，来它替尼、吉非替尼等酪氨酸激酶抑制剂作为阳性对照，吉西他宾等非酪氨酸激酶抑制剂作为阴性对照，通过比较待测物在脂筏色谱上的特异性保留筛选出中药的抗肿瘤活性部位，实验结果与MTT法测定细胞毒性的结论一致。
本发明为中药及其提取物的抗肿瘤活性部位特别是新型酪氨酸蛋白激酶抑制剂的高效筛选提供了新的技术方法，具有广泛的应用前景。
有益效果
(1)由于U251细胞提取的脂筏富含TrkA，本发明首次建立的TrkA脂筏-硅胶固定相色谱系统，固定相能与酪氨酸激酶受体为靶点的药物特异性结合产生保留，而非酪氨酸激酶靶点药物在该TrkA脂筏-砖胶色谱柱中无保留行为，说明富含TrkA受体的脂筏-砖胶色谱是一种具有生物亲和特性、能够选择性识别与TrkA受体作用的药物的新型药物筛选模型。该色谱系统与传统的色谱系统不同，具有色谱分离与活性识别的“双重”特性，因此可以用于以TrkA受体为靶标的先导药物筛选研究。
(2)本发明经不同时间和不同流动相的使用，证明TrkA脂筏-硅胶固定相色谱系统稳定，色谱柱重复性较好，使用寿命长，具有良好的应用前景。
附图说明
图1.免疫荧光倒置显微镜图(A：脂筏，B：脂筏-砖胶色谱固定相)。
图2.脂筏-硅胶固定相装柱前后的特异性免疫荧光(A：低压装柱前的固定相；B：低压装柱后未经使用的脂筏-砖胶固定相；C：连续使用15天后的脂筏-硅胶固定相；D：连续使用30天后的脂筏-硅胶固定相)。
图3.经不同流动相处理后的脂筏-硅胶固定相特异性免疫荧光(A：10mM乙酸铵，pH7.4；B：2％胆酸钠+10mM乙酸铵，pH7.4；C：100μM胆固醇+2％胆酸钠+10mM乙酸铵，pH7.4；D：40μM卵磷脂+2％胆酸钠+10mM乙酸铵，pH7.4；E：40μM卵磷脂+100μM胆固醇+2％胆酸钠+10mM乙酸铵，pH7.4)。
图4.不同固定相上的保留行为(A：纯砖胶固定相，分析物--来他替尼；B：TrkA脂筏-硅胶固定相，分析物--吉西他宾；C：TrkA脂筏-硅胶固定相，分析物--来他替尼；D：TrkA脂筏-硅胶固定相，分析物--吉非替尼)。
图5.MTT法测定五倍子醚提部位及不同药物对U251细胞抑制率的结果(72h)/％(A：样品组--细胞培养24h后即加入不同浓度的样品；B：K252A组--细胞培养24h后加入200nmol/L的K252A，继续培养24h后，加入不同浓度的样品；C：TrkA一抗组--细胞培养24h后加入1∶100的TrkA一抗，继续培养24h后，加入不同浓度的样品)。
图6.五倍子提取物的脂筏-硅胶色谱图。
图7.葶苈子提取物的脂筏-砖胶色谱图。
图8.香加皮提取物的脂筏-砖胶色谱图。
具体实施方式
实施例1：以脂筏修饰的硅胶层析柱的制备
(1)U251细胞的培养及扩增：
用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养和扩增U251细胞，调整细胞数浓度为1×107～10×107个/ml，备用；
(2)脂筏的制备：
收集上述方法所得的U251细胞，以非离子型去污剂TritonX-100抽提脂筏组分，蔗糖密度梯度离心法离心收集，将脂筏-蔗糖混悬液置4℃，pH7.2的80mMTris-HCL溶液中透析20h，合并透析液共9ml备用；
(3)脂筏修饰的层析硅胶的制备：
将层析硅胶小球混悬于1mol/L盐酸溶液中，超声处理10min；搅拌下同流1h；蒸馏水洗涤，重复操作2次；抽干，于110℃活化5h，作为砖胶载体备用；取9ml含有脂筏的Tris-HCL溶液加入5g活化处理后的砖胶中，置2℃，恒温振摇20h；22℃静置1h；加入pH7.2的100mMTris-HCL15ml，混匀后静置3min；2℃500rpm离心8min，弃去上清，加入PBS，混匀后放置3min；重复三次；得到表面修饰有脂筏的砖胶的混悬液；
(4)以上述方法得到的表面修饰有脂筏的砖胶的混悬液为填料湿法装柱(共3支，50mm×4.6mm)，即得以脂筏修饰的硅胶色谱柱。
实施例2：在线筛选五倍子中抗肿瘤活性部位的脂筏-硅胶色谱模型的建立方法
(1)五倍子萃取物的制备
药材五倍子干燥后粉碎。取400g药粉，加入石油醚(1.5∶1)均匀搅拌，静置1h，去除石油醚，重复3次，晾干。加入双蒸水，95℃同流2h，重复2次，收集提取液。用旋转蒸发仪浓缩至300ml，加入95％乙醇搅拌，静置过夜。过滤，取滤液，用旋转蒸发仪将乙醇蒸出，加少许水蒸至无乙醇味，用乙醚提取，用旋转蒸发仪浓缩得到的浸膏为乙醚萃取部位。
(2)五倍子萃取物的脂筏色谱分离
将五倍子的乙醚萃取物进行本发明所构建的TrKA脂筏色谱柱分离，根据脂筏色谱柱上的保留行为，确定有无活性部分。色谱条件如下：色谱柱为本发明所构建的TrKA脂筏色谱柱(50mm×4.6mm，粒径50μm)，流动相为10mM乙酸铵，pH7.4，流速0.2mL·min-1，柱温：37.0℃，检测波长：254nm。
实验结果提示五倍子乙醚萃取物在脂筏-硅胶色谱柱上有保留行为，保留时间约为4.8-17.2min。因此推断五倍子乙醚萃取物具有抑瘤活性。
(3)MTT法体外抗肿瘤活性评价
MTT法抑制肿瘤细胞增殖结果(表2)显示，脂筏色谱筛选出的具有抑瘤活性的乙醚萃取部分体现出良好的肿瘤细胞抑制效果。
表2五倍子乙醚提取物抗肿瘤活性实验(U251)
实施例3：在线筛选五倍子中抗肿瘤活性部位的脂筏-硅胶色谱模型的建立方法
(1)五倍子萃取物的制备
药材五倍子干燥后粉碎。取80g药粉，加入石油醚(1∶1)均匀搅拌，静置2h，去除石油醚，重复3次，晾干。加入双蒸水，水浴同流3小时，重复2次，收集提取液。用旋转蒸发仪浓缩至60ml，加入95％乙醇搅拌，静置过夜。过滤，取滤液，用旋转蒸发仪将乙醇蒸出，加少许水蒸至无乙醇味，用乙醚提取，用旋转蒸发仪浓缩得到的浸膏为乙醚萃取部位。
砖胶柱分离乙醚萃取物，配制不同比例的二氯甲烷-乙醚(5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1)洗脱液各200ml，梯度洗脱，洗脱液浓缩，烘干，得到5个不同亚部位。
(2)MTT法体外抗肿瘤活性评价
乙醚萃取部位进行本发明构建的脂筏-硅胶色谱分析，结果提示五倍子乙醚萃取部位在脂筏-砖胶色谱柱上有保留行为，因此推断五倍子乙醚萃取物具有抑瘤活性(详见实施例2)。进一步对乙醚萃取物的亚部位进行体外抗肿瘤活性评价。
MTT法抑制肿瘤细胞增殖结果(表3)显示，五倍子乙醚萃取部分的组分3(为乙醚萃取部位用硅胶柱分离，二氯甲烷/乙醚梯度洗脱的体积比例为3∶1的洗脱物)具有明显的增值抑制作用。
表3五倍子乙醚提取物抗肿瘤活性实验(U251)
实施例4：在线筛选葶苈子中抗肿瘤活性部位的脂筏色谱模型的建立方法
(1)葶苈子不同萃取部位的制备
药材葶苈子，粉碎。取适量药粉，加入双蒸水，水浴同流2次，每次2h，收集滤液。用旋转蒸发仪浓缩至200mL，加入95％乙醇搅拌，静置过夜。过滤，取滤液，用旋转蒸发仪将乙醇蒸出，加少许水蒸至无乙醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯与水饱和正丁醇萃取，用旋转蒸发仪浓缩得到的浸膏分别为石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水饱和正丁醇萃取部位及萃取后水相部分。
(2)葶苈子提取物的脂筏-砖胶色谱分离
将葶苈子提取物的浸膏进行本发明所构建的TrKA脂筏-砖胶色谱柱分离，根据在脂筏-硅胶色谱柱上的保留行为，确定有无活性部分。色谱条件如下：色谱柱为本发明所构建的TrKA脂筏砖胶色谱柱(50mm×4.6mm)，流动相为10mM乙酸铵，pH7.2～7.4，流速0.2mL·min-1，柱温：37.5℃，检测波长：200～600nm。
葶苈子水提物在脂筏-硅胶色谱柱上有保留行为(图7)，保留时间为12.5～20.6min。推断葶苈子萃取物具有抑瘤活性。
实施例5：在线筛选葶苈子中抗肿瘤活性部位的脂筏色谱模型的建立方法
(1)葶苈子不同萃取部位的制备
药材葶苈子，粉碎。取适量药粉，加入双蒸水，水浴同流2次，每次3h，收集滤液。用旋转蒸发仪浓缩至原药材1倍量，加入95％乙醇搅拌，静置过夜。过滤，取滤液，用旋转蒸发仪将乙醇蒸出，加少许水蒸至无乙醇味，用乙酸乙酯萃取，剩下的水液过大孔吸附树脂，依次用水、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇洗脱，收集各部位。
(2)MTT法体外抗肿瘤活性评价
葶苈子水提物进行本发明构建的脂筏-硅胶色谱分析，结果提示提取物在脂筏-硅胶色谱柱上有保留行为，因此推断其具有抑瘤活性(详见实施例4)。进一步对大孔吸附树脂洗脱物进行体外抗肿瘤活性评价，MTT法抑制肿瘤细胞增殖结果(表5)显示，过大孔吸附树脂所得馏分中，30％乙醇洗脱物对U251有一定的抑制作用，浓度为100μg/mL时，抑制率为30.95％。
表4葶苈子提取物抗肿瘤活性实验（U251）
实施例6：在线筛选香加皮中抗肿瘤活性部位的脂筏色谱模型的建立方法
(1)香加皮不同萃取部位的制备
药材香加皮干燥后粉碎。取适量药粉，加入双蒸水，水浴同流2次，收集滤液。用旋转蒸发仪浓缩至约250ml，加入95％乙醇搅拌，静置过夜。过滤，取上清液，用旋转蒸发仪将乙醇蒸出，加少许水蒸至无乙醇味，依次用乙酸乙酯与正丁醇提取，用旋转蒸发仪浓缩得到的浸膏分别为乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位及萃取后水相部分。
(2)香加皮提取物的脂筏-硅胶色谱分离
将香加皮提取物的浸膏进行本发明所构建的TrKA脂筏-砖胶色谱柱分离，根据在脂筏-砖胶色谱柱上的保留行为，确定是否有活性。色谱条件同上。发现香加皮水提物在脂筏-砖胶色谱柱上有保留行为(图8)，保留时间为8.1～28.4min。因此推断香加皮具有抑瘤活性成分。
实施例7：在线筛选香加皮中抗肿瘤活性部位的脂筏色谱模型的建立方法
(1)香加皮不同萃取部位的制备
药材香加皮干燥后粉碎。取适量药粉，加入双蒸水，水浴同流2次，收集滤液。用旋转蒸发仪浓缩至约250ml，加入95％乙醇搅拌，静置过夜。过滤，取上清液，用旋转蒸发仪将乙醇蒸出，加少许水蒸至无乙醇味，依次用乙酸乙酯与正丁醇提取，用旋转蒸发仪浓缩得到的浸膏分别为乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位及萃取后水相部分。
上述乙酸乙酯、正丁醇样品，分别用适量甲醇溶解，与8g硅胶混匀放入烧瓶，55℃下旋转蒸发至干，得柱层析样品。配置不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱液。依次冲洗，收集冲洗液，真空干燥得14个部位样品(编号1～14)。
(2)MTT法体外抗肿瘤活性评价
香加皮提取物在脂筏-砖胶色谱柱上有保留行为，因此推断其具有抑瘤活性(详见实施例7)。进一步对香加皮水提物各亚部位进行U251肿瘤细胞的MTT抑制增殖实验，结果显示(表7)正丁醇组分11(为正丁醇样过硅胶柱层析、用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱的体积比例为10∶1的洗脱物)具有明显的增值抑制作用，当组分11浓度由5μg/mL增大至50μg/mL时，对U251的抑制率相应增大，达到77.34％。
表5香加皮水提物亚部位的抗肿瘤活性实验（U251）