一种动物源食品中类固醇激素残留的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种动物源食品中类固醇激素残留的检测方法。即以有机醇做萃取剂，利用液液微萃取技术分离富集动物源食品中类固醇激素，结合高效液相色谱测定，方法检出限为0.008ng/mL。本发明的方法操作简单，有机溶剂用量少，富集倍数高，检测时间短，能有效地与干扰物质分离，是一种简便、快速、准确的分析方法，具有实际的应用意义。
【专利说明】—种动物源食品中类固醇激素残留的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种有效的新型涡旋辅助-液液微萃取高效液相色谱法检测动物源食品中类固醇激素残留的检测方法，属于分析化学中痕量大分子的分离富集和分析测定【技术领域】。
[0002]研究背景:
雌二醇、雌酮、己烯雌酚、睾酮、炔雌醇和黄体酮等都属于类固醇类激素，可用于治疗女性性功能疾病、更年期综合征、骨质疏松，作为口服避孕药以及对预防放射线、对脂质的代谢都有十分有利的作用。有关研究早已证明了残留在动物源食品中的雌激素能扰乱激素平衡，导致妇女的更年期紊乱、生育能力下降，女童性早熟，男性女性化，并具有强致癌、致畸作用，诱发女性乳腺癌、卵巢癌等疾病，对人体健康极为不利。
[0003]2002年3月，我国农业部公布《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》，并将8种同化性激素(去甲雄三烯醇酮、甲基睾丸酮、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙、醋酸甲羟孕酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚和玉米赤霉醇)列为禁用兽药。日本规定牛肉中雌三醇、孕酮的MRL为0.01mg/kg ;美国规定牛肉、羊肉中孕酮MRL为0.003mg/kg ;韩国规定牛肉中孕酮的MRL也为0.003mg/kg ;欧盟性激素类兽药规定:雌酮、雌二醇及雌三醇MRLs ( I μ g/kg，炔雌醇MRLs ( 0.7 μ g/kg,己烯雌酚其盐、酯及制剂在所有动物组织中不得检出。
[0004]目前，比较经典的分析检测激素的处理方法主要有比色法、免疫分析法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法和气相色谱-质谱联用法。主要的分离富集方法有分散液液萃取(DLLME)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)等。本研究组之前利用分散液液微萃取(DLLME)对生物样品中肾上腺激素的检测进行过较深入的研究，已经取得了不错的效果，并申请了发明专利，申请号CN201210107015.9。但经过进一步研究发现，DLLME对被测目标物的极性要求很高，若萃取剂选择不当则回收率下降且存在多种激素检测受限的问题。通过涡旋辅助-液液微萃取(VA-LLME)，选用有机醇类物质做萃取剂，通过涡旋乳化，对目标物可以达到更高的萃取率且可以直接稀释进样，具有有机溶剂种类及用量减少、操作简单、环保，富集倍数高。较分散液液微萃取(DLLME)具有更明显的优势。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种动物源食品中类固醇激素残留的检测新方法，该方法对基体复杂的动物源食品采用涡旋辅助-液液微萃取对目标物进行前处理和富集，结合高效液相色谱同时测定多种痕量类固醇激素，具有操作简单，富集倍数高，结果准确等特点。
[0006]本发明是利用涡旋液液微萃取高效液相色谱法检测动物源食品中类固醇激素残留的方法，包括以下步骤:
(I)工作曲线的制作:配制一系列不同浓度的类固醇激素混合标准溶液，在一定色谱条件下，注入高效液相色谱进行分析，测定峰面积与类固醇激素的线性范围、回收率、标准偏差和检测限及工作曲线的线性回归方程。一般采用的配制浓度为5.00、20.00、50.00、100.00,200.00,400.00,600.00,800.00、1000 ng/mL。[0007](2)样品处理
I、奶制品:取1.0~5.0g奶样,加入l-3g无水硫酸钠和1~2mL乙腈、或者1~2mL
0.1%-1%的乙酸，涡旋20-60S，在转速3000~10000r/min条件下离心分离5~20min，取上
清液备用；
II、肉制品:取0.5-2.0g剁碎的肉样，加入1~2mL甲醇、无水乙醇或者乙腈中的一种，超声5~15min,,在3000~1000Or / min条件下离心分离5~20min,取上清液备用；
II1、蛋制品:取去壳后的蛋样1.0-3.0g，搅匀，加入1~2mL甲醇、无水乙醇、乙腈或者二氯甲烧中的一种，超声5~15min,在3000~10000r / min条件下离心分离5~20min,
取上清液备用。
[0008](3)涡旋辅助-液液微萃取:将100-1000 μ I萃取剂，加入备用样品中，用蒸馏水定容到5mL,润旋,形成乳池体系,然后在2000-5000 r/min下离心3~10 min ；
(4)样品测定:弃去步骤(3)中的下层水相，吸取剩余离心管底部的有机相，过滤，在与步骤(1)相同色谱条件进行HPLC分析，并对照步骤(1)所得的线性回归方程，计算出样品中类固醇激素的含量。
[0009]本发明中类固醇激素为雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睾酮、己烯雌酚、黄体酮中一种或几种。
[0010]色谱流动相为:乙腈-水，梯度洗脱:0~4.5 min,乙腈35% ；4.5~6.0 min,乙臆 55% ；6.0 ~15 min,乙臆 35%。
[0011]本发明中萃取剂为正丁醇、异丁醇、正辛醇、异辛醇中一种。
[0012]本发明方法的最低定量限为0.008ng/mL。
[0013]相对于现有技术，本发明具有以下显著优点:
1、本方法能够对动物源食品进行净化，减少了其他物质的干扰；
2、本发明提供了一种新的液液微萃取体系，实验证明本发明方法能有效地富集类固醇激素(雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睾酮、己烯雌酚、黄体酮)，并且该方法安全，简便，快捷和高效，有机溶剂用量少，富集倍数高，检测时间短，能有效地与干扰物质分离，集采样、萃取、浓缩为一体，是一种简便、快速、准确的分析方法，具有广泛的应用前景。
[0014]3、本发明选用有机醇类作为萃取剂，通过涡旋乳化形成匀相，再离心破乳，萃取率高，与高效液相色谱法结合，大大提高该仪器的测定灵敏度，动物源食品中类固醇激素浓度≥ 0.008ng/mL均能检出。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0016]实施例1:本检测类固醇激素含量的方法，检测肉制品中类固醇激素(雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睾酮、己烯雌酚、黄体酮)的含量，具体操作如下:
1)工作曲线制作-M lgg/mL的标准母液按比例配制成5.00,20.00,50.00、100.00、200.00,400.00,600.00,800.00、1000 ng/mL等不同浓度的雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睾酮、己烯雌酚、黄体酮混合标样，进行色谱分析，回归方程、线性范围、相关系数等见表1 ;
色谱条件为以乙腈-水作为流动相，梯度洗脱为质量百分比浓度35%乙腈洗脱O~4.5min，质量百分比浓度55%乙腈洗脱4.5~6.0 min，质量百分比浓度35%乙腈洗脱6.0~15 min ；
2)取2.0g奶样，加入Ig无水硫酸钠和1.5mL乙腈,润旋30s,在转速5000r/min条件下离心分离15min,取上清液,备用；
3)将300μI正丁醇，加入2)所得上清液中，用蒸馏水定容到5mL，涡旋10s，形成乳浊体系；
4)将步骤3)的离心管在4000r/min离心4 min ；
5)弃去步骤4)中的下层水相，吸取剩余离心管底部的有机相，过滤，然后进行HPLC分析，色谱条件同步骤I);
6)将步骤(5)所得到的色谱峰面积代入表I工作曲线，测出牛奶中雌酮15ng/mL，己烯雌酌.5ng/mL。
[0017]表1:类固醇激素的线性方程 实施例2:
本检测类固醇激素含量的方法，检测肉制品中类固醇激素(雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睾酮、己烯雌酚、黄体酮)的含量，具体操作如下:
1)工作曲线制作方法同实施例1中步骤I);
2)取3.0g剁碎的牛肉样,加入2mL甲醇,超声15min,在6000r / min条件下离心分离lOmin，取上清液，备用；
3)将400μ I异丁醇，加入2)所得上清液中，用蒸馏水定容到5mL，涡旋20s，形成乳浊体系；
4)将步骤3)的离心管在5000r/min离心8 min ；
5)弃去步骤4)中的下层水相，吸取剩余离心管底部的有机相，过滤，然后进行HPLC分析，色谱条件同步骤I);
6)将步骤5)所得到的色谱保留时间与混合标准工作液中对应的保留时间对比，没有色谱峰出现，牛肉样中未检出类固醇激素。
[0018]实施例3:
本检测类固醇激素含量的方法，检测肉制品中类固醇激素(雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睾酮、己烯雌酚、黄体酮)的含量，具体操作如下:
1)工作曲线制作方法同实施例1中步骤I);
2)取去壳后的鸡蛋样4.0g，加入1.0mL 二氯甲烷，超声lOmin，在6000r / min条件下离心分离15min，取上清液，备用；
3)将200μI异辛醇，加入2)所得上清液中，用蒸馏水定容到5mL，涡旋15s，形成乳浊体系；
4)将步骤3)的离心管在3500r/min离心10 min ；
5)弃去步骤4)中的下层水相，吸取剩余离心管底部的有机相，过滤，然后进行HPLC分析，色谱条件同步骤I);
6)将步骤5)所得到的所得到的色谱峰面积代入表I工作曲线，检出鸡蛋样中雌二醇含量为5ng/mL，雌酮含量为15ng/mL。
【权利要求】
1.一种动物源食品中类固醇激素残留的检测方法，其特征在于包括以下步骤: (I)工作曲线的制作:配制5-1000 ng/mL类固醇激素混合标准溶液,在一定色谱条件下，进行高效液相色谱分析，制作工作曲线，得到类固醇激素的检出限和线性回归方程；(2)样品处理:1、奶制品:取1.0?5.0g奶样,加入I?3g无水硫酸钠和I?2mL乙腈、或者I?2mL 0.1%-1%的乙酸，涡旋20?60s，在转速3000?10000r/min条件下离心分离5?20min，取上清液备用;11、肉制品:取0.5-2.0g剁碎的肉样，加入I?2mL甲醇、无水乙醇或者乙腈中的一种,超声5?15min,在3000?IOOOOr / min条件下离心分离5?20min,取上清液备用JI1、蛋制品:取去壳后的蛋样1.0-3.0g,搅勻,加入I?2mL甲醇、无水乙醇、乙腈或者二氯甲烧中的一种，超声5?15min,在3000?IOOOOr / min条件下离心分离5?20min，取上清液备用。(3)液液微萃取:将100-1000 μ I萃取剂，加入备用样品中，润旋10?30s,形成乳池体系,在2000-5000 r/min下离心3?10 min; (4)样品测定:弃去步骤(3)中的下层水相，吸取剩余离心管底部的有机相，过滤，在与步骤(I)相同色谱条件进行HPLC分析，并对照步骤(I)所得的线性回归方程，计算出样品中类固醇激素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种动物源食品中类固醇激素残留的检测方法，其特征在于:类固醇激素为雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睾酮、己烯雌酚、黄体酮中一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种动物源食品中类固醇激素残留的检测方法，其特征在于:色谱条件为以乙腈-水作为流动相，梯度洗脱为体积百分比浓度35%乙腈洗脱O?4.5min,体积百分比浓度55%乙腈洗脱4.5?6.0 min,体积百分比浓度35%乙腈洗脱6.0?15 min。
4.根据权利要求1所述的一种动物源食品中类固醇激素残留的检测方法，其特征在于:动物源食品包括奶制品，肉制品和蛋制品。
5.根据权利要求1所述的一种动物源食品中类固醇激素残留的检测方法，其特征在于:萃取剂为正丁醇、异丁醇、正辛醇、异辛醇中一种。
【文档编号】G01N30/02GK103869001SQ201210527492
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月10日 优先权日:2012年12月10日
【发明者】杨亚玲, 王佩瑾 申请人:昆明冷木捷商贸有限公司, 云南健牛生物科技有限公司