检测水产品中喹诺酮类药物的elisa试剂盒的制作方法

专利名称：检测水产品中喹诺酮类药物的elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测喹诺酮类药物残留量的试剂盒，特别是检测水产品中喹诺酮类药物残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA (Enzyme Linked ImmunosorbentAssay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶免技术。
背景技术：
喹诺酮类抗菌药(4-quinolones),又称批酮酸类或批唳酮酸类，是一类较新的合成抗菌药，该类药物的开发可以追溯到1962年,Lesher从合成抗痕药氯喹中分离出一种副产品-萘啶酸，喹诺酮类历经40多年的发展，共开发出了四代喹诺酮类药物，共计50多种药物。喹诺酮类抗菌药以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶位，通过选择性的抑制细菌DNA促旋酶与拓扑异构酶IV而造成染色体的不可逆损害，而使细菌细胞不再分裂，主要作用于革兰阴性菌的抗菌药物，对革兰阳性菌的作用较弱(某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用)。已成为兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，被大量用于治疗、预防和促生长，由于其耐药性和潜在的致癌性引起广泛的关注。在组织中，恩诺沙星的标示残留物为恩诺沙星和环丙沙星，其中以肝脏组织和肾脏组织中的残留物浓度最高，其次是肌肉和脂肪附着的皮肤组织，恩诺沙星其代谢产物环丙沙星(CIF)仍具有生物活性。氧氟沙星(OFL)其主要以原形药物的形式存在于组织中；培氟沙星(PEF)在体内代谢率接近100%，而其代谢产物是诺氟沙星(N0R)。本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，与高效液相等仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的喹诺酮类药物残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中喹诺酮类药物残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种检测水产品中喹诺酮类药物残留量的酶联免疫试剂盒，试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔中预包被偶联抗原，样本中残留的喹诺酮类药物和微孔中预包被的偶联抗原竞争抗喹诺酮类药物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留喹诺酮类药物的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中喹诺酮类药物的残留量。本实用新型所提供的一种检测水产品中喹诺酮类药物的ELISA试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、14瓶试剂，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔中预包被喹诺酮类药物偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶
3喹诺酮类药物标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。还包括一张盖板膜和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，盒体是硬纸盒；96孔试剂板为聚苯乙烯酶标板，放于真空铝钼袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的白色PE塑料瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位共15个，由塑料泡沫制成。酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被喹诺酮类药物偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗I瓶，7ml ;抗体工作液I瓶，7ml ;显色液A液I瓶，7ml ;显色液B液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml ;浓缩洗涤液I瓶，40ml ;浓缩复溶液I瓶，50ml。经实验表明本试剂盒具有很闻的灵敏度水广品样本的最低检测限为l.Oyg/kg,回收率为80%±20%，相对于其他喹诺酮类药物检测方法，本试剂盒所需仪器较少，且所需仪器同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于水产品中喹诺酮类药物残留量的检测。

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I为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图3为本实用新型酶标板的俯视4为本实用新型盖板膜平面5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面6为本实用新型固定泡沫模具的俯视7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。
(长为 8. 55cm)(长为 12. 8cm)
具体实施方式
一、试剂盒组装酶标反应微孔条(2)预包被喹诺酮类药物偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(I)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2);透明帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽￠)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽￠)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的白色塑料试剂瓶
(8)用于封装7ml酶标二抗，绿色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装7ml喹诺酮类药物抗体工作液，黑色帽的白色塑料试剂瓶(9)用于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)
4有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液(11)，7ml显色液A液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml喹诺酮类药物抗体工作液瓶位(16)，7ml酶标二抗瓶位(15)，7瓶Iml/瓶各种浓度的标准品溶液瓶位(17)，盒体为(19)是硬纸盒。二、样本的前处理I.配液配液I :O. IM氢氧化钠溶液称取2. Og氢氧化钠，加500ml去离子水溶解混匀配液2 复溶工作液用去离子水将5X浓缩复溶液按1:4体积比进行稀释(I份5X浓缩复溶液+4份去离子水)用于样本的复溶，复溶工作液在4°C环境下可保存一个月配液3 洗涤工作液用去离子水将20X浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释(I份20X浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月2.样本处理步骤(I)取2. 0±0· 05g均质样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入Iml O. IM氢氧化钠溶液，再加入7ml乙腈，用振荡器充分振荡5min ；3000g以上，室温(20 25°C /68 77 °F)离心 IOmin ；(2)取2ml上清液于IOml玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；(3)加入Iml正已烷用涡旋仪涡动30s，再加入Iml复溶工作液，涡动30s，3000g以上，室温(20 25°C /68 77 °F)离心5min ；(4)除去上层有机相，取下层50μ I用于分析。三、使用试剂盒的操作步骤I、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(2(T25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于疒8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品/样本/酶标二抗和抗体工作液加标准品/样本50 μ I到对应的微孔中，直接加入酶标二抗50μ I/孔，再加入抗体工作液50μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min。6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ I/孔，充分洗涤4^5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、显色加入底物液A液50μ I/孔，再加底物液B液50μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。8、测定加入终止液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。[0043]四、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第I种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与喹诺酮类药物的含量成负相关。I、用样本的平均吸光度值与标准品比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本I的吸光度值为O. 258，样本2的吸光度值为O. 956，标准液吸光度值分别是0ppb为I. 988 ;
O.2ppb 为 I. 454 ；0. 6ppb 为 O. 842 ；1. 8ppb 为 O. 454 ；5. 4ppb 为 O. 182 ；16. 2ppb 为 O. 078。则样本I的浓度范围是I. 8ppb^5. 4ppb，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中喹酮类药物残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0.2pplT0.6ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中喹酮类药物残留的浓度范围。2、定量判定(I)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光率(％)=B/B0X 100%B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值Btl — Oppb标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中喹诺酮类药物实际浓度。五、注意事项I、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(2(T25’ C)会导致所有标准的OD值偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、试剂混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。4、反应终止液为2mol/L硫酸,避免接触皮肤。5、储存条件保存试剂盒于2 8°C，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。6、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。O标准的吸光度值小于0.5(A450nm<0. 5)时，表示试剂可能变质。8、加A, B液后一般显色15min即可,若颜色较浅,可延长显色时间到20min (或更长)，但不得超过25min。反之，则减短反应时间。9、该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
权利要求1.一种检测水产品中喹诺酮类药物的ELISA试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、14瓶试剂，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔中预包被喹诺酮类药物偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶喹诺酮类药物标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。
2.根据权利要求I所述的ELISA试剂盒，其特征在于还包括一张盖板膜和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，盒体是硬纸盒；96孔试剂板为聚苯乙烯酶标板，放于真空铝钼袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的白色PE塑料瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位共15个，由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求I所述的ELISA试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被喹诺酮类药物偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗I瓶，7ml ;抗体工作液I瓶，7ml ;显色液A液I瓶，7ml ;显色液B液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml ;浓缩洗涤液I瓶，40ml ;浓缩复溶液I瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测水产品中喹诺酮类药物残留量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、喹诺酮类药物抗体工作液、喹诺酮类药物6个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、高浓度标准品、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔中预包被偶联抗原，样本中含有的喹诺酮类药物将和微孔中预包被的偶联抗原竞争结合抗喹诺酮类药物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中喹诺酮类药物的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在水产品中喹诺酮类药物的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK202735340SQ20122011157
公开日2013年2月13日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者万宇平, 陶光灿, 冯静, 王礼贵, 顾蓉蓉, 杨昌松, 韩京朋, 石洁 申请人:北京勤邦生物技术有限公司