方波热循环的制作方法
【专利摘要】本文公开的实施方式涉及用于分析解链温度，并且特别涉及用于分析双螺旋核酸的方法和系统。
【专利说明】方波热循环
[0001]发明背景【技术领域】
[0002]本文公开的实施方式涉及用于分析解链温度，并且特别涉及用于分析双螺旋核酸的方法和系统。
[0003]相关技术描述
[0004]解链曲线分析可用于推论关于双螺旋核酸的长度、序列、GC含量和互补性的信息。如此，解链曲线分析广泛地用于各种各样的应用，比如检测单核苷酸多态性(SNP)和通过产生的解离图形区分纯合的野生型、杂合的和纯合的突变等位基因。另外，在聚合酶链式反应(PCR)之后解链曲线分析可用于检测假的扩增产物。
[0005]然而，当前可用的解链曲线分析技术具有局限性，尤其是就维持样品之间和重复分析之间的一致性而言。因此，需要改进核酸的解链曲线分析的速度和准确度的方法和系统。
【发明内容】
[0006]本技术涉及用于分析核酸解链曲线，尤其是关于双螺旋核酸分子的方法和系统。在本技术的一些实施方式中，这种方法和系统允许具有改进的速度和准确度的解链温度的分析。
[0007]在本文呈现的技术的一些实施方式中，提供了一种确定双螺旋核酸分子的解链温度的方法，其允许核酸解链曲线分析的改进的速度和准确度。该方法可包括使包括双链核酸分子的溶液经历方波温度梯度，该梯度包括引起双链核酸分子至单链核酸分子的至少一种转换的温度范围；并且在方波温度梯度的过程中检测该至少一种转换。
[0008]在一些实施方式中，方波温度梯度可包括一系列温度脉冲，每个脉冲包括:将溶液的温度升高至第一高温；将溶液的温度下降至第二低温；其中第一高温高于第二低温；并且其中，在随后的脉冲中，将第一高温和第二低温每个调节至分别高于先前脉冲中的第一和第二温度。
[0009]本文还呈现了一种确定双螺旋核酸分子的解链温度的方法，该方法包括使包括多个单链核酸分子的溶液经历方波温度梯度，该梯度包括引起单链核酸分子至双链核酸分子的至少一种转换的温度范围；并且在方波温度梯度的过程中检测该至少一种转换。
[0010]在一些实施方式中，方波温度梯度可包括一系列温度脉冲，每个脉冲包括:将溶液的温度升高至第一高温；将溶液的温度下降至第二低温；其中第一高温高于第二低温；并且其中，在随后的脉冲中，将第一高温和第二低温每个调节至分别低于先前脉冲中的第一和第二温度。
[0011]本文还呈现了一种用于确定双螺旋核酸分子的解链温度的系统，该系统包括可编程的热循环装置；检测器；和一种用于方波热循环的程序，该程序包括用于以下的指令:使包括双链核酸分子的溶液经历方波温度梯度，该梯度包括引起双链核酸分子至单链核酸分子的至少一种转换的温度范围；并且在方波温度梯度的过程中检测该至少一种转换。
[0012]在以上系统的一些实施方式中，方波温度梯度包括一系列温度脉冲，每个脉冲包括:将溶液的温度升高至第一高温；将溶液的温度下降至第二低温；其中第一高温高于第二低温；并且其中，在随后的脉冲中，将第一高温和第二低温每个调节至分别高于先前脉冲中的第一和第二温度。
[0013]本文还呈现了一种确定双链核酸分子的解链温度的方法，该方法包括:提供包括双链核酸分子并且在存在双螺旋核酸的情况下具有特征可检测的信号的报道部分的样品；使该样品经历一系列温度脉冲，其中至少多个脉冲引起双链核酸分子转换成单链分子并且转换回成双链分子；以及使用报道部分产生的信号检测双链核酸分子的解链温度。
[0014]在一些实施方式中，每个温度脉冲包括:将溶液的温度升高至第一高温；将溶液的温度下降至第二低温；其中第一高温高于第二低温；并且其中，在随后的脉冲中，将第一高温和第二低温每个调节至分别高于先前脉冲中的第一和第二温度。
[0015]本文还提供了一种确定核酸的双链至单链转换的动力学信息的方法，该方法包括:提供包括双链核酸分子并且在存在双螺旋核酸的情况下具有特征可检测的信号的报道部分的样品；使该样品经历一系列温度脉冲，其中脉冲引起双链核酸分子转换成单链分子并且转换回成双链分子；以及使用报道部分产生的信号检测在单链和双链状态之间的转换t匕，由此状态之间的转换比提供了关于转换的动力学信息。
[0016]本文还呈现了一种确定双螺旋核酸分子的解链温度的方法，该方法包括:使包括单链核酸分子的溶液经历方波温度梯度，该梯度包括引起单链核酸分子至双链核酸分子的至少一种转换的温度范围；并且在方波温度梯度的过程中检测该至少一种转换。
[0017]在一些实施方式中，方波温度梯度可包括一系列温度脉冲，每个脉冲包括:将溶液的温度升高至第一高温；将溶液的温度下降至第二低温；其中第一高温高于第二低温；并且其中，在随后的脉冲中，将第一高温和第二低温每个调节至分别低于先前脉冲中的第一和第二温度。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是显示方波温度曲线的一个例子的图。温度显示在Y-轴和时间显示在X-轴。星号指示在曲线期间进行信号检测的时间。
[0019]图2是显示方波温度曲线的一个例子的图，温度显示在Y-轴和时间显示在X-轴。
[0020]图3是显示常规的解链曲线分析的图。指示双链核酸的荧光信号显示在Y-轴。温度显不在X-轴。
[0021]优选的实施方式详述
[0022]本文提供了基于在单链和双链形式之间的解离温度一一也被称为解链曲线一解析核酸结构的方法和系统。该方法和系统利用具有阶梯的方波热曲线，并且涉及在每一阶梯高点和低点处测量荧光。
[0023]常规的解链曲线分析涉及频繁对包含报道试剂的溶液体积光学取样，所述报道试剂随着双链DNA响应温度上升解离而改变其报道特性，例如强度。然而，由于若干问题，高精密解离方法准确地和可再生地报道解链温度的能力受到限制。例如，在标准解离曲线分析中，难以获得热控制的均一性，并且从溶液至溶液的准确度难以再现。另外，解离不是新现象，并且因为转换包括热力学和动力学方面的混合，所以在双链和单链形式之间的转换具有一定的幅度。常规的解离方法也通常取决于荧光对温度迹线的导数以去卷积重叠的解离特征。然而，导数峰的解析通常被荧光读取中的噪声所限制。
[0024]为了实现具有相似的解链温度的核酸结构的良好解析，通常用热循环装置的非常缓慢和精确的控制收集常规的解链曲线。用于常规分析的热曲线是线性的，与用在扩增反应中的斜率相比，具有极其缓的斜率。然而，在许多情况中，由于应用的温度的不确定性，斜率难以精确地控制并且这表现在解链温度结果的变化。因此，测量时间长，以允许温度的缓慢过渡以及在该温度范围频繁地进行的光学测量，以克服光学系统的噪声限制。
[0025]更进一步，因为要求的读数频率通常高于扫描器读取所有样品的能力，用于一些设备的光学扫描器不是很好的适合于常规的解链曲线分析。如此，常规的扫描设备的替代方案包括:1)减慢热升温速率以适应光学扫描头(然而，这增加了运行时间，并且对热控制系统增加了更多限制)；或2)每次对一个样品进行解链曲线(也增加了总的运行时间长度)。
[0026]鉴于以上常规的解链曲线分析的局限性，令人意外地发现解链曲线分析可以类似扫描伏安法的形式进行。具体地，在使用扫描伏安法解析混合溶液的电化学中遇到的问题在某些方面与在常规的解链曲线分析中遇到的问题类似。热曲线的类似是应用至电极的电压的扫描。电化学中混合物的解析是使用线性斜坡上重叠的方波曲线。
[0027]因此，本文呈现的是解链曲线分析新形式的令人意外发现，其允许快速确定双螺旋核酸分子或不同的双螺旋核酸分子的混合物的解链温度。在某些实施方式中，该方法包括:使包括双链核酸分子的溶液经历方波温度梯度，该梯度包括引起双链核酸分子至单链核酸分子的至少一种转换的温度范围；并且在方波温度梯度的过程中检测该至少一种转换。
[0028]如本文所使用的，术语方波指通常通过阶梯状的曲线定义的振荡图形。在热曲线的背景下，方波图形在高温和低温之间交替，具有瞬时或准瞬时的过渡。然而，由于产生波形的系统的物理限制，理想的方波实际上通常不能实现。信号从低水平升至高水平并且又降回所需的时间通常分别称为上升时间和下降时间。取决于使用的热循环系统，上升时间和下降时间将从准瞬时至一些有限的时间变化。如此，将认识到在高水平和低水平之间，以及在低水平和高水平之间的过渡，可不导致具有垂直过渡的热曲线。因此，当绘制温度对时间的函数时，术语方波可包括其中温度过渡的斜率具有一些正的或负的斜率的图形。
[0029]另外，本文呈现的方波曲线可包括在每个高温和低温处的保持时间。保持时间的长度可如需要的变化以允许检测双链和单链核酸之间的转换。因此，在瞬时检测的实施方式中，保持时间可以是零或接近零。在其它实施方式中，检测可涉及一定有限的时间，并且因此可维持高温或低温如需要的长度，以检测核酸是否处于单链或双链形式。在一些实施方式中，保持时间可如需要的调节以允许核酸分子达到平衡。在一些实施方式中，保持时间可以是约O秒，少于约I纳秒，少于约10纳秒，少于约100纳秒，少于约I微秒，少于约10微秒，少于约100微秒，少于约I毫秒，少于约10毫秒，少于约100毫秒，少于约I秒，少于约2、3、4、5、6、7、8、9或10秒或10秒或更多。
[0030]本文呈现的方波温度曲线典型地重叠在温度梯度上。如本文所使用的，温度梯度指随着时间推移温度的改变。在常规的解链曲线分析中，温度梯度是线性的并且具有缓的斜率以便于严密地控制温度。在本文呈现的温度曲线中，温度梯度可具有总体正或总体负斜率。因此，当方波图形重叠在正斜率温度梯度或负斜率温度梯度上时，所得的图形类似上行的或下行的阶梯，如图1和图2中所显示。
[0031]因此，在某些实施方式中，方波温度梯度包括一系列温度脉冲，每个脉冲包括:将溶液的温度升高至第一高温；将溶液的温度下降至第二低温；其中第一高温高于第二低温。在其中温度曲线具有总体正斜率的实施方式中，在随后的脉冲中，每个第一高温和第二低温典型地被调节至分别高于先前脉冲中的第一和第二温度。在其中温度曲线具有总体负斜率的实施方式中，在随后的脉冲中，每个第一高温和第二低温典型地被调节至分别低于先前脉冲中的第一和第二温度。将认识到在一些实施方式中，在一个或多个脉冲之间高温和低温可保持相同并且仍产生具有总体正或负斜率的温度曲线。相似地，在一些实施方式中，在一个或多个脉冲中的高温和低温可低于先前脉冲并且仍产生具有总体正斜率的温度曲线。同样，在一些实施方式中，在一个或多个脉冲中的高温和低温可高于先前脉冲，并且仍产生具有总体负斜率的温度曲线。
[0032]在某些实施方式中，至少一个温度脉冲可包括其中在双链核酸分子和单链核酸分子之间发生可检测的转换的温度范围。例如，具有正总体斜率的曲线典型地开始于包括高温和低温的脉冲，其每个低于双螺旋核酸的解链温度。同样，具有负总体斜率的曲线典型地开始于包括高温和低温的脉冲，其每个高于双螺旋核酸的解链温度。在这种实施方式中，一个或多个随后的脉冲经过双螺旋核酸的解链温度，并且检测双链至单链核酸的转换，或单链至双链核酸的转换。
[0033]如本文所使用的，可检测的转换指指示双螺旋核酸的存在或缺失的信号的改变。为了识别可检测的转换，本方法采用在温度脉冲中的一个或多个点处检测信号。在某些实施方式中，检测发生在每个温度脉冲期间。将认识到在可选实施方式中，检测不需要发生在每个温度脉冲中。例如，在其中不配置用于多样品的同时检测的单检测器的检测系统中，检测器可检测第一个样品在第一脉冲期间的信号，并且然后检测第二个样品在第二脉冲期间的信号。
[0034]为了识别一种或多种可检测的转换，在温度曲线期间进行多点检测。在某些实施方式中，检测设定为在脉冲中的离散点处进行。例如，在一些实施方式中，检测在每个温度脉冲中的高温和低温处进行。在一些实施方式中，检测可在整个温度曲线进行，并且是持续的或接近持续的。
[0035]本文提供的方法和系统可进一步包括识别具有从双链核酸至单链核酸分子的最大可检测转换的温度脉冲。通过与常规的解链曲线类似，解链温度典型地通过信号对温度曲线的取导数识别。导数用于识别一个或多个指示样品中具体的核酸种类的解链温度的拐点。核酸种类的解链温度通常称为解离温度，其中50%的种类为双螺旋形式和50%为单链形式。破坏两条核酸之间的碱基-碱基氢键需要的能量，并且因此解链温度取决于其长度、GC含量和其互补性。可影响解链温度的其它因素包括溶液的盐浓度(例如见Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第二版(Cold Spring HarborLaboratory, (1989);通过引用并入本文)、溶液的pH,以及去污剂、抗衡离子、溶剂的存在，以及本领域技术人员已知的其它因素。在本文呈现的方法中，具有最大可检测的转换的温度脉冲的识别用于确认解链温度，而不必进行常规解链曲线典型地需要的另外的导数分析。因此，在某些实施方式中，识别最大可检测的转换包括计算在单个温度脉冲内的高温处和低温处测量的可检测信号的差别。然后对比每个脉冲的可检测信号的差别，以识别在高温和低温之间具有最大信号差别的脉冲。
[0036]在具体的溶液中的核酸分子可以是完全均质的，其中每个双链核酸种类具有相同的一级序列和互补序列，并且因此具有相同的解链温度。在其它实施方式中，溶液可以是非均质的，包括多个核酸种类，其中与其它双链种类的一级序列和互补序列相比，溶液中的两个或多个双链种类每个具有不同的一级序列和互补序列。因此，基于每个种类特有的解链温度，可以区分甚至具有仅 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或仅 20或更多碱基对差别的核酸种类。
[0037]本文呈现的方法和系统中的核酸种类可以是具有可检测的解链温度的任何核酸种类。术语核酸或寡核苷酸或本文语法上的等同物意味着共价地键合在一起的至少两个核苷酸。本发明的核酸通常包含磷酸二酯键，虽然在一些情况中，如以下概述，包括可具有替代主链的核酸类似物，包括，例如，磷酰胺(Beaucage等，Tetrahedron49 (10):1925(1993)和其中的参考文献；Letsinger, J.0rg.Chem.35:3800 (1970) ；Sprinzl 等，Eur.J.Biochem.81:579 (1977) ；Letsinger 等，Nucl.Acids Res.14: 3487 (1986) ；Sawai 等，Chem.Lett.805 (1984), Letsinger 等，J.Am.Chem.Soc.110:4470 (1988);和 Pauwels 等,Chemica Scripta26:14191986)),硫代憐酸酯(Mag 等，Nucleic Acids Res.19:1437 (1991);和美国专利号 5，644，048)，二硫代磷酸酯(Briu 等，J.Am.Chem.Soc.111:2321 (1989)，O-甲基亚憐酸胺键(见 Eckstein,Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, Oxford UniversityPress)，和妝核酸主链和键(见 Egholm, J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992) ；Meier 等，Chem.1nt.Ed.Engl.31:1008 (1992) ；Nielsen, Nature, 365: 566 (1993) ；Carlsson 等，Nature380:207(1996)，通过引用将其所有并入)。其它类似物核酸包括具有正电荷主链(Denpcy 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92:6097 (1995);非离子主链(美国专利号 5，386，023、5，637，684、5，602，240、5，216，141 和 4, 469, 863 ；Kiedrowshi 等，Angew.Chem.1ntl.Ed.English30:423 (1991) ；Letsinger 等，J.Am.Chem.Soc.110:4470 (1988)；Letsinger 等，Nucleoside&Nucleotidel3:1597 (1994)；第 2 和 3 章，ASC SymposiumSeries580, ^CarbohydrateModification in Antisense Research", Ed.Y.S.Sanghui和 P.Dan Cook ；Mesmaeker 等，Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4:395(1994) ；Jeffs等，J.Biomolecular NMR34:17 (1994) ；Tetrahedron Lett.37:743 (1996))和非核糖主链的那些，包括在美国专利号5，235，033和5，034，506以及ASC Symposium Series580,^CarbohydrateModification in Antisense Research",Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook第6和7章中描述的那些。包含一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义中(见Jenkins等，Chem.Soc.Rev.(1995) pp.69-176)。在 Rawls, C&E News Jun.2，1997ρ.35 中描述了若干核酸类似物。所有这些参考文献通过引用明确并入此处。例如，可进行磷酸核糖主链的修饰以便于标记的添加，或增加这种分子在生理环境中的稳定性和半衰期。术语核苷包括核苷酸以及核苷和核苷酸类似物，以及修饰的核苷，比如氨基修饰的核苷。另外，核苷包括非天然存在的类似物结构。因此例如每个包含碱基的肽核酸的各个单元在本文称为核苷。
[0038]因此，核酸种类可以是DNA、RNA的任何形式或类似物，以及其人工的和合成的变体。核酸种类可包括天然存在的和非天然的核苷酸类似物的任何结合。核酸种类可包括一个或多个核苷酸，其中核苷酸的戊糖或核苷酸碱基或一个或多个磷酸酯已被其各自的类似物取代。在某些实施方式中，示例性磷酸酯类似物包括，但不限于烷基膦酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代憐酸酯(phosphorodithioate)、硒代憐酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代憐酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代憐酸酯(phosphoroani1thioate)、苯胺憐酸酯(phosphoroaniIidate)、氨基磷酸酯、硼磷酸酯(boronophosphate)等，并且可包括相关的抗衡离子。将认识到以上列出的或核酸种类的任何其它修饰型与其未修饰的对应物相比可影响种类的Tm。
[0039]核酸分子可包括，但不限于,基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA, RNA小分子，包括不限于miRNA和miRNA前体、siRNA、stRNA、snoRNA、其它非编码RNA(ncRNA)，断裂的核酸，从细胞核、细胞质、亚细胞器比如线粒体或叶绿体获得的核酸，以及从可在生物学样品上或其中出现的微生物或DNA或RNA病毒获得的核酸。例如，核酸分子可以是线性的、环状的、发夹型的或任何其它结构，其允许至少一部分核酸分子与另一种分子或其本身形成双链相互作用。
[0040]核酸分子可包括一个或多个通用碱基。术语通用碱基旨在指与天然存在的核苷酸，即阿糖腺苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，比天然存在的核苷酸之间形成较少氢键的核苷酸类似物。通用碱基可以是缺少氢键基团但是仍可有效地包装在双螺旋DNA中的疏水碱基类似物，与天然碱基配对可显示几乎无选择性。Mi I lican, T.A.等(1984)Nuc.Acids Res.12:7435-7453 ；Schweitzer, B.A.等(1995) J.Am.Chem.Soc.117:1863-1872 ；Matray, T.J.等(I999)Nature399 = 7CM-7O85Ogawa1A-K.等(2OOO)J.Am.Chem.Soc.122:3274-3287，通过引用将其公开内容全部明确并入本文。已描述了可非选择性地杂交每个天然碱基的核碱基类似物。Van Aerschot, A.等(1995)Nucl.Acids Res.23:4363-4370 ;Zhang, P.等(1998)Nucl.Acids Res.26:2208-2215 ；Seela, F.等(1999), Nucleosides Nucletodiesl8:425-441 ；Bergstrom, D.E.等(1997)Nucl.AcidsRes.25:1935-1942 ；Asomova, 0.等(1997)Nucl.Acids Res.25:1930-1934 ；Bergstrom, D.E.,等(1995) J.Am.Chem.Soc.117: 120卜1209 ;Loakes, D.等(1995) Nucl.AcidsRes.23:2361-2366 ；Loakes, D.等(1995) Nucl.Acids Res.22:4039-4043 ;Nichols, R.等(1994)Nature369:492-493。如本领域技术人员所认识，在本发明中可使用所有已知的核酸类似物。可用在本文描述的方法和组合物中的通用碱基的非限制性例子包括:脱氧肌苷、3-硝基吡咯(1，2)、或4_，5-,或6-硝基吲哚的脱氧核苷酸、1-(2’ -脱氧-β -D呋喃核糖基)-4_硝基吡唑，以及1-(2’ -脱氧-β -D呋喃核糖基)-4-硝基咪唑。
[0041]在一些实施方式中，核酸是肽核酸(PNA)，其包括肽核酸类似物。这些主链在中性条件下基本上是非离子的，与天然存在的核酸的高电荷磷酸二酯主链形成对比。这产生了两个优势。第一，PNA主链展现改进的杂交动力学。相对于完美匹配的碱基对，由于错配，PNA的解链温度(Tm)较大改变。由于内部错配，DNA和RNA的Tm典型地展现2_4°C的下降。利用非离子PNA主链，下降更接近7-9°C，因此允许更好检测错配。相似地，由于其非离子特性，附连在这些主链的碱基的杂交对于盐浓度相对不敏感。
[0042]脱氧肌苷(〃dl〃)是通用碱基的优选例子。肌苷能够与A、C、T或G形成两个氢键(见 Barker, R., Organic Chemistry of Biological Molecules, Prentice-Hall, N.J.(1971);也见 Martin 等(1985), Nucl.Acids Res.13(24):8927-8938)。通用碱基的其它优选例子包括1-(2’_脱氧-β -D呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、1-(2’_脱氧-β -D呋喃核糖基)-4-硝基吡唑、1- (2’ -脱氧-β -D呋喃核糖基)-4-硝基咪唑和1- (2’ -脱氧-β -D呋喃核糖基)-4_硝基吲哚。
[0043]术语双链核酸分子、双螺旋核酸和类似术语指以氢键结合的、典型地与DNA相关的螺旋阵列存在的一对核酸分子或相同分子的部分。术语双链核酸分子、双螺旋核酸和类似术语也指基本上双链的那些配对分子，意味着包含由第一条核酸上的寡核苷酸引发位点的化学合成或第二条核酸的酶促合成中的设计或错误引起的短错配区比如单、二或三核苷酸的那些。双链核酸分子可作为双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链或RNA/DNA共聚物存在，其中术语“共聚物”指包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸二者的单链核酸。在典型的实施方式中，双链核酸是使用任何本领域技术人员已知的用于检测双链核酸分子的许多方法，比如检测来自嵌入染料的荧光，能够检测的那些。术语单链核酸分子，指不以双链形式存在的核酸分子或其部分。
[0044]双链核酸种类将典型地包括在一个或多个区中互补或基本上互补的两条链。如本文所使用的，术语互补和基本上互补指在核苷酸或核酸之间，比如，例如在两条双链DNA分子之间或在寡核苷酸引物和待测序或扩增的单链核酸上的引物结合位点之间的杂交或碱基对。因此，基本上互补序列可指与参考序列相比，同一性百分数范围是从100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、85、80、75或更少，或之间的任何数值的序列。
[0045]互补核苷酸通常是A和T (或A和U)或C和G。当一条核苷酸——最佳地对齐和对比并且具有适当的核苷酸插入或缺失一与另一条核苷酸至少约80%、通常至少约90%至95%以及更典型地从约98至100%配对时，两个单链RNA或DNA分子被称为基本上互补的。
[0046]优势
[0047]本技术提供比常规的解链曲线分析许多令人意外的优势。第一，方波热循环使用热循环装置的设计意图，即快速改变温度的能力，而不是以一种违背设计意图的方式试图控制热循环装置。使用快速热坡度而不是缓慢的热梯度快速地完成扫描。
[0048]第二，方波方法固有地是导数方法，从而不需要另外的数据处理来确定解链温度。假定识别出最佳波形，波形允许用少量的总体测量更多解析重叠转换。
[0049]第三，阶梯函数热曲线更灵敏，因为在扫描过程期间报道分子具有机会在状态之间(即解链的相对于退火的)翻转许多次。
[0050]第四，该方法是减法技术，从而背景水平对分析信号产生显著更少的干扰。
[0051]方波热曲线提供动力学信息，因为报道分子在状态之间重复地翻转。如果动力学在一个方向受限制，那么反应的形状将会改变。
[0052]本文呈现的方法具有易于以合适程序在任何热循环装置上进行的另外优势。
[0053]将认识到方波可从低温递升至高温，或反之亦然。可调节每个方波脉冲的脉冲高度，以覆盖不同的温度跨度。一些典型的实施方式可使用等于使用常规的解链曲线测量的转换的宽度的一半的方波高度。以总体测量时间为代价，可改变在给定的平均温度下测量的脉冲数目，以降低噪声并且提高精确度。[0054]本文呈现的方法与应用至电化学系统的方波伏安法具有一些类似。在电化学中，成阶梯状的是电压而不是温度。
[0055]图1阐述了方波热曲线的一个实施方式。如图1中所显示，方波阶梯曲线包括在线性斜坡上重叠的方波。总体坡度是温度相对于时间向下的梯度。在坡度过程期间曲线包括多个脉冲。在每个脉冲处，使溶液经历宽的温度范围，并且在两点检测信号。
[0056]图2代表了另一个热曲线坡度，温度随着时间总体增加。如图2中所指示，温度曲线经过一系列脉冲。每个脉冲包括过渡跳跃。如本文所使用的，过渡跳跃是温度从低温(!Y)增加至高温(Th)。在图2显示的实施方式中，对于每个随后的脉冲，IY增加使得每个随后的脉冲中的?Υ高于先前脉冲中的?Υ。相似地，增加TH，使得每个随后的脉冲中的Th高于先前脉冲中的TH。在每个脉冲内，平均温度Ti定义为IY和Th的和的一半。
[0057]在一些实施方式中，双螺旋核酸经由在存在双螺旋核酸的情况下具有特征可检测的信号的报道部分检测。在图2示例的热曲线中，双螺旋核酸经由在存在双螺旋核酸的情况下具有荧光信号的报道部分检测。在每个脉冲内的?Υ和Th处获取荧光读数，产生每个脉冲的低温读数(FLh)和高温读数(FLh)。每个脉冲的荧光变化(AFL)是该脉冲的FL1^P FLh之间的差。
[0058]脉冲之间的温度阶梯
[0059]如本文所使用的，每个脉冲中低温的温度阶梯(Λ TstqJ可描述为一个脉冲中的IY和先前脉冲中的 ?Υ的差。相似地，每个脉冲中高温的温度阶梯(ATstepll)可描述为一个脉冲中的Th和先前脉冲中的Th的差。将认识到Λ TstepL或Λ Tstepa可以是任何的温度改变，其导致温度随时间的总体正斜率或总体负斜率。因此，具有正Λ TstepL和/或Λ Tstepa的一系列脉冲将产生总体正斜率。同样，具有负Λ TstepL和/或Λ Tstepa的一系列脉冲将产生总体负斜率。
[0060]如本文所使用的，正总体斜率指其中平均Λ TstepL和/或Λ Tstepa是正的曲线。典型地，具有正总体斜率的曲线开始于低于双螺旋DNA的解链温度的IY和Th温度。典型地，具有正总体斜率的曲线结束于高于双螺旋DNA的解链温度的IY和Th温度。
[0061]因此，在一些实施方式中，总体斜率是正的。在一些这样的实施方式中，整个曲线的每个ATstep是正的。例如，在典型的实施方式中，每个随后的I；大于每个之前的IY值。然而，将认识到，在某些其中热曲线具有正斜率的实施方式中，一个或多个?Υ值可低于之前的?Υ值，并且随着时间仍导致具有正总体温度斜率的曲线。相似地，在一些具有正总体斜率的实施方式中，每个随后的Th值将大于每个之前的Th值。然而，将认识到，在某些其中热曲线具有正斜率的实施方式中，一个或多个Th值可低于之前的Th值，并且随着时间仍导致具有正总体温度斜率的曲线。
[0062]如本文所使用的，负总体斜率指其中平均Λ TstepL和/或Λ Tstepa是负的曲线。典型地，具有负总体斜率的曲线开始于高于双螺旋DNA的解链温度的IY和Th温度。典型地，具有负总体斜率的曲线结束于低于双螺旋DNA的解链温度的IY和Th温度。
[0063]因此，在某些实施方式中，总体斜率是负的。在一些这样的实施方式中，整个曲线的每个ATstep是负的。例如，在典型的实施方式中，每个随后的I；低于每个之前的IY值。然而，将认识到，在某些其中热曲线具有负斜率的实施方式中，一个或多个?Υ值可大于之前的?Υ值，并且随着时间仍导致具有负总体温度斜率的曲线。相似地，在具有负总体斜率的典型的热曲线中，每个随后的Th值将低于每个之前的Th值。然而，将认识到，在某些其中热曲线具有负斜率的实施方式中，一个或多个Th值可大于之前的Th值，并且随着时间仍导致具有正总体温度斜率的曲线。
[0064]因此，在一些实施方式中，ATstepL的绝对值可以是，例如，低于约0.001°C、或约
0.0010C>0.01°C、0.1°C、0.2°C、0.3°C、0.4°C、0.5°C、0.6°C、0.7°C、0.8°C、0.9°C、1.(TC、
1.1 °C > 1.2 °C > 1.3 °C > 1.4 °C > 1.5 °C > 1.6 °C > 1.7 °C > 1.8 °C > 1.9 °C >2.0 °C >2.1 °C >2.2 °C >
2.3 °C >2.4 °C >2.5 °C >2.6 °C >2.7 °C >2.8 °C >2.9 °C >3.0 °C >3.1 °C >3.2 °C >3.3 °C >3.4 °C >
3.5 °C >3.6 °C >3.7 °C >3.8 °C >3.9 °C >4.0 °C >4.1 °C >4.2 °C >4.3 °C >4.4 °C >4.5 °C >4.6 V、
4.7 °C >4.8 °C >4.9 °C >5.0 °C >5.1 °C >5.2 °C >5.3 °C >5.4 °C >5.5 °C >5.6 °C >5.7 °C >5.8 V、
5.9 °C >6 °C >7 °C >8 °C >9 °C > 10 °C > 11 °C > 12 °C > 13 V、14 °C、15 V、16 °C、17 V、18 °C、19 V、约20°C或更多，以及其之间的任何温度值。在典型的实施方式中，ATst_范围的绝对值在从约1.(TC至约5.(TC之间。在一些实施方式中，ΛTst_对于曲线中的每个脉冲是相同的。例如，如图2中所显示，Λ Tst_对于每个脉冲是相同的。将认识到在其它实施方式中，曲线的一个或多个脉冲中的ATst_可以不同。
[0065]相似地，在一些实施方式中，ATstepll的绝对值可以是，例如，低于约0.001°C、或约 0.001°C>0.01°C>0.1°C>0.2°C>0.3°C>0.4°C>0.5°C>0.6°C>0.7V、0.8°C>0.9°C>1.(TC、
1.1 °C > 1.2 °C > 1.3 °C > 1.4 °C > 1.5 °C > 1.6 °C > 1.7 °C > 1.8 °C > 1.9 °C >2.0 °C >2.1 °C >2.2 °C >
2.3 °C >2.4 °C >2.5 °C >2.6 °C >2.7 °C >2.8 °C >2.9 °C >3.0 °C >3.1 °C >3.2 °C >3.3 °C >3.4 °C >
3.5 °C >3.6 °C >3.7 °C、3.8 °C、3.9 °C、4.0 °C、4.1 °C、4.2 °C、4.3 °C、4.4 °C、4.5 °C、4.6 V、
4.7 °C >4.8 °C >4.9 °C >5.0 °C >5.1 °C >5.2 °C >5.3 °C >5.4 °C >5.5 °C >5.6 °C >5.7 °C >5.8 V、
5.9 °C >6 °C >7 °C >8 °C >9 °C > 10 °C > 11 °C > 12 °C > 13 V、14 °C、15 V、16 °C、17 V、18 °C、19 V、约20°C或更多，以及在其之间的任何温度值。在典型的实施方式中，ATst_范围的绝对值在从约1.(TC至约5.(TC之间。在一些实施方式中，Λ Tst_对于曲线中的每个脉冲是相同的。例如，如图2中所显示，Λ Tst_对于每个脉冲是相同的。将认识到在其它实施方式中，在曲线的一个或多个脉冲中的ATst_可以不同。
[0066]脉冲内的温度过渡
[0067]如本文所使用的，温度过渡跳跃高度(Λ Ttrans)指脉冲内的高温Th和低温IY之间的差。将认识到ATtrans可以是任何适合的温度范围。例如，在一些实施方式中，脉冲的ATtans 可以是，例如，低于约 0.001。。、或约 0.0Ol0C>0.0rc、0.rc、0.2°C>0.3°C>0.4°C、
0.5 °C、0.6 °C、0.7 °C、0.8 °C、0.9 °C、1.0 °C、1.1 °C、1.2 °C、1.3 °C、1.4 °C、1.5 °C、1.6 °C、
1.7 °C > 1.8 °C > 1.9 °C >2.0 °C >2.1 °C >2.2 °C >2.3 °C >2.4 °C >2.5 °C >2.6 °C >2.7 °C >2.8 °C >
2.9 °C >3.0 °C >3.1 °C >3.2 °C >3.3 °C >3.4 °C >3.5 °C >3.6 °C >3.7 °C >3.8 °C >3.9 °C >4.0 °C >
4.1 °C、4.2 °C、4.3 °C、4.4 °C、4.5 °C、4.6 °C、4.7 °C、4.8 °C、4.9 °C、5.0 °C、5.1 °C、5.2 V、
5.3 °C >5.4 °C >5.5 °C >5.6 °C >5.7 °C >5.8 °C >5.9 °C >6 °C >7 °C >8 °C >9 °C > 10 °C > 11 °C > 12 °C >13°C、14°C、15°C、16°C、17°C、18°C、19°C、约20°C或更多，以及在其之间的任何温度值。在典型的实施方式中，ATtrans范围在从约5°C至约10°C之间。在一些实施方式中，ATtrans对于曲线中的每个脉冲是相同的。例如，如图2中所显示，ATtans对于每个脉冲是相同的。将认识到在其它实施方式中，曲线的一个或多个脉冲中八1\^可以是不同的。
[0068]虽然ATtans可以是任何适合的温度范围，但一种确定方波热曲线的有用AIteans的方法是测量相应于在常规解链曲线中的脉冲宽度的一半的温度范围。具体地，如图3中所显示，常规的解链曲线在从低至高的温度范围内测量嵌入染料的荧光。常规的解链曲线可典型地被分割成三个温度范围:1)低温区，其中荧光相对高并且不变；2)过渡区，其中荧光水平随着温度上升而下降；和3)高温区，其中荧光相对低并且不变。解链温度通常落在其中荧光的下降达到拐点的点处。因此，例如，常规解链曲线中的过渡区可能跨越范围从50°C至70°C的20°C区域。在这样的实例中，过渡宽度的一半将是10°C跨度。因此，使用本文呈现的热曲线分析相同的双螺旋核酸，有用的过渡跳跃高度ATtrans将是10°C，或常规解链曲线上过渡宽度的一半。
[0069]系统和设各
[0070]本文还提供了一种用于确定双螺旋核酸分子的解链温度的系统。该系统可包括可编程的热循环装置；检测器；和用于方波热循环的程序，其中该程序包括用于以下的指令:使包括双链核酸分子的溶液经历方波温度梯度，该梯度包括引起双链核酸分子至单链核酸分子的至少一种转换的温度范围；并且在方波温度梯度过程中检测该至少一种转换。
[0071]可编程的热循环装置可以是任何适合的允许进入检测器以检测一个或多个核酸样品中的转换的这种装置。可编程的热循环设备是本领域技术人员已知的。例如，用于聚合酶链式反应的设备能够在温度之间快速循环。
[0072]检测器可以是能够检测单链和双链核酸之间的转换的任何适合的检测器。用于检测报道部分比如嵌入染料的荧光的检测器是本领域熟知的。同样，用于检测UV吸光度的检测器是本领域熟知的。在一些实施方式中，该系统进一步包括光源。在存在双螺旋核酸的情况下将吸光度或荧光用作特征可检测信号的地方可使用光源。用于UV吸收的光源以及提供用于荧光的激发光的光源是本领域熟知的。
[0073]如本文所使用的，术语程序指执行任务或过程的指令或命令。术语程序可与术语模块互换地使用。在某些实施方式中，程序可以是在同一套命令下执行的各种各样的指令的编译。在其它实施方式中，程序可指离散的程序组或文档。
[0074]通过检测器获得的程序以及信号数据可存储于任何适合的存储容量。如本文所使用的，术语存储器、存储设备、存储容量等可指存储信息的任何介质、设备或方式。存储器可包括，但不限于，磁盘驱动设备比如硬盘、软盘、光盘或磁光盘，内存比如RAM或ROM芯片，以及用于记录或存储数据的任何其它介质。在一些实施方式中，将存储容量连接至处理器，其获得之后，将记录的信息发送至存储容量。在具体的实施方式中，通过系统获得信号数据并且记录在存储容量上。在其它实施方式中，通过系统获得信号数据并且信息首先被处理，并且将处理的信息记录在存储容量上。
[0075]双螺旋核酸的检测
[0076]在本文提供的方法中，通过检测指示双螺旋核酸水平的信号，监测单链和双链核酸之间的转换。通过本领域已知的任何适合的方法进行双螺旋核酸水平的检测。例如，在存在双螺旋核酸的情况下使用具有特征可检测的信号的报道部分可检测双螺旋核酸水平。在存在双螺旋核酸的情况下具有特征可检测的信号的报道部分是本领域技术人员所熟知的，并且可产生任何可检测的信号。典型地，信号是光学信号，比如荧光、比色、发光或混浊(turbidic)。在一些实施方式中，信号可以是电学的，比如电压、电阻或电流的改变。
[0077]在典型的实施方式中，报道部分是嵌入染料。嵌入染料显示不同的荧光发射，取决于它们与双链或单链DNA的关联。具体地，它们与双链DNA特定地结合，并且当它们结合时，它们发明亮的荧光。在缺失双链DNA的情况中，它们不结合任何东西，它们仅以低水平发荧光。适合的商业可得的荧光染料的例子包括SYBR Green、LC Green、LC Green Plus、ResoLight、EvaGreen、Chromofy、SYT09、溴化乙淀、Y0-PR0_l、Hoechst33258和Pico Green。将认识到可使用在存在双螺旋核酸的情况下展现特征可检测的信号的任何适合的嵌入染料。
[0078]在典型的实施方式中，特征可检测的信号是可逆的。如此，随着温度曲线重复地经过多脉冲中的双螺旋核酸的解链温度，特征可检测的信号可被有效地“开”和“关”。因此，嵌入染料非常适于作为报道部分，因为它们优先结合双螺旋核酸，并且当温度升高造成双螺旋解链时，信号则减少，直到温度再次达到可进行退火的水平。将认识到在本文呈现的方法中可利用产生可逆信号的任何适合的报道部分。
[0079]在一些实施方式中，检测不涉及报道部分，但是可涉及监测双链或单链核酸的固有特性。固有特性可以是允许监测单链和双链核酸之间的转换的双链或单链核酸的任何适合的特性。在一些实施方式中，固有特性是UV吸光度。例如，单链DNA比双链DNA更强吸收260nm的紫外光。因此，在260nm或任何其它适合的波长下吸光度的改变可用作与单链核酸相比双链核酸水平的工具。
[0080]动力学信肩、
[0081 ] 双螺旋核酸的解链是包括热力学和动力学方面的混合的现象。在常规的解链曲线分析中，动力学数据——通常在解链曲线中视为不对称——可被噪声混淆。有利地，本方法可提供转换的动力学的深刻理解，因为核酸分子在状态之间重复地翻转。如果有在一个方向相比另一方向发生更快的转换的倾向，它可以认定为重复地经过过渡温度的曲线。
[0082]因此，本文呈现的是一种确定关于核酸的双链至单链转换的动力学信息的方法，该方法包括:提供包括双链核酸分子的样品和在存在双螺旋核酸的情况下具有特征可检测的信号的报道部分；使该样品经历一系列温度脉冲，其中脉冲引起双链核酸分子转换成单链分子并且转换回成双链分子；以及使用报道部分产生的信号检测在单链和双链状态之间的转换比，从而在状态之间的转换比提供了关于转换的动力学信息。
[0083]已一般地描述了本发明，通过参考某些具体实施例可获得进一步理解，本文提供某些具体实施例仅为了说明目的，并不旨在限制。
实施例
_4] 实施例1 -使用方波热曲线检测患者群体中多态性的杂合性
[0085]以下预期性实施例阐释了本文上述方波热曲线的一个应用。为了检测患者群体中多态性的存在，从人群中的一组患者收集基因组DNA样品。使用在潜在多态性侧翼的引物，通过聚合酶链式反应扩增感兴趣的区域。具体地，设计将扩增包含多态性区域的引物。作为引物设计的结果，取决于扩增哪个具体的等位基因，产生了在多态性的区域中具有不同序列的扩增产物。因此，取决于扩增哪个等位基因，产物也将具有相差至少1.5°C的解链温度。
[0086]使每个PCR产物经历解链曲线分析。将SYBR Green添加至样品，然后将其置于热循环/检测装置中。解链曲线温度曲线在45°C开始并遵循方波图形，对于每个脉冲的低温和高温具有5°C过渡和2°C阶梯。该曲线遵循该脉冲图形直到达到76°C的最终温度。
[0087]数据分析识别荧光值的脉冲最大过渡。在一些样品中，在相差1.5至2.(TC的温度下识别两个Tm点。在其它样品中，在两个温度任何一个识别仅单个Tm点。基于这些发现，将患者样品分类为多态性的杂合，或阳性或阴性的纯合。
[0088]以上描述公开了本发明的数个方法和系统。本发明的方法和材料容易被修改，并且装配方法和装置容易被改变。考虑本公开或本文公开的发明的实践，这种修改对于本领域技术人员是显而易见的。因此，本发明不意欲限于本文公开的【具体实施方式】，而是覆盖落在本发明的真实范围和精神内的所有修改和替代方案。
[0089]本文弓I用的所有参考——包括但不限于公布的和未公布的申请、专利和文献参考——通过引用将其全部并入本文，并且由此组成本说明书的一部分。如果通过引用并入的公开和专利或专利申请与包含在该说明书中的公开相矛盾，则本说明书旨在代替和/或优先于任何这种矛盾的材料。
[0090]如本文所使用的术语“包括(comprising) ”与“包括(including) ”、“包含(containing) ”或“特征在于”是同义的，并且是囊括性的或开放式的并且不排除另外的未叙述的元素或方法步骤。
【权利要求】
1.一种确定双螺旋核酸分子的解链温度的方法，所述方法包括 使包括双链核酸分子的溶液经历方波温度梯度，所述梯度包括引起所述双链核酸分子至单链核酸分子的至少一种转换的温度范围；和 在所述方波温度梯度的过程中检测所述至少一种转换。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方波温度梯度包括一系列温度脉冲，每个脉冲包括: a)使所述溶液的温度升高至第一高温； b)使所述溶液的温度下降至第二低温； 其中所述第一高温高于所述第二低温；并且 其中，在随后的脉冲中，将每个所述第一高温和所述第二低温调节至分别高于先前脉冲中的所述第一和第二温度。
3.权利要求2所述的方法，其中至少一个所述温度脉冲包括在所述双链核酸分子和所述单链核酸分子之间发生可检测的转换的温度范围。
4.权利要求2所述的方法，其中所述检测发生在每个所述温度脉冲中的所述第一高温和所述第二低温处 。
5.权利要求2所述的方法，其中所述方法进一步包括: 识别具有从双链核酸至单链核酸分子的最大可检测的转换的温度脉冲。
6.权利要求5所述的方法，其中所述识别包括计算可检测的信号的差异，所述可检测的信号在单个温度脉冲内的所述第一高温和所述第二低温处测量。
7.权利要求1所述的方法，其中所述溶液包括多个双链核酸种类，每个所述种类包括不同的序列。
8.权利要求7所述的方法，其中每个所述多个双链核酸种类包括不同的解链温度。
9.权利要求1所述的方法，其中所述检测包括在存在双螺旋核酸的情况下检测具有特征可检测信号的报道部分。
10.权利要求9所述的方法，其中所述特征可检测信号是可逆的。
11.权利要求9所述的方法，其中所述报道部分包括荧光染料。
12.权利要求9所述的方法，其中所述报道部分选自:溴化乙锭、YO-PRO-1、Hoechst33258、Pico Green 和 SYBR Green。
13.权利要求1所述的方法，其中所述检测包括监测紫外线(UV)吸收。
14.权利要求1所述的方法，其中所述方波温度梯度使用可编程的热循环仪产生。
15.一种用于确定双螺旋核酸分子的解链温度的系统，所述系统包括 可编程的热循环装置； 检测器；和 用于方波热循环的程序，所述程序包括用于以下的指令: 使包括双链核酸分子的溶液经历方波温度梯度，所述梯度包括引起所述双链核酸分子至单链核酸分子的至少一种转换的温度范围；和 在所述方波温度梯度的过程中检测所述至少一种转换。
16.权利要求15所述的系统，其中所述方波温度梯度包括一系列温度脉冲，每个脉冲包括:a)使所述溶液的温度升高至第一高温； b)使所述溶液的温度下降至第二低温； 其中所述第一高温高于所述第二低温；和 其中，在随后的脉冲中，将每个所述第一高温和所述第二低温调节至分别高于先前脉冲中的所述第一和第二温度。
17.权利要求16所述的系统，其中至少一个所述温度脉冲包括在所述双链核酸分子和所述单链核酸分子之间发生可检测的转换的温度范围。
18.权利要求16所述的系统，其中所述检测发生在每个所述温度脉冲中的所述第一高温和所述第二低温处。
19.权利要求16所述的系统，其中所述程序进一步包括用于以下的指令: 识别具有从双链核酸至单链核酸分子的最大可检测的转换的温度脉冲。
20.权利要求19所述的系统，其中所述识别包括计算可检测的信号的差异，所述可检测的信号在单个温度脉冲内的所述第一高温和所述第二低温处测量。
21.权利要求15所述的系统，其中所述检测包括监测紫外线(UV)吸收。
22.权利要求15所述的系统，其中所述方波温度梯度使用可编程的热循环仪产生。
23.一种确定双链核酸分子的解链温度的方法，所述方法包括: 提供包括双链核酸分子和在存在双螺旋核酸的情况下具有特征可检测信号的报道部分的样品； 使所述样品经历一系列温度脉冲，其中至少多个所述脉冲引起所述双链核酸分子转换成单链分子并且转换回成双链分子；和 使用所述报道部分产生的信号检测所述双链核酸分子的解链温度。
24.权利要求23所述的方法，其中每个所述温度脉冲包括: a)使所述溶液的温度升高至第一高温； b)使所述溶液的温度下降至第二低温； 其中所述第一高温高于所述第二低温；和 其中，在随后的脉冲中，将每个所述第一高温和所述第二低温调节至分别高于先前脉冲中的所述第一和第二温度。
25.权利要求24所述的方法，其中至少一个所述温度脉冲包括在所述双链核酸分子和所述单链核酸分子之间发生可检测的转换的温度范围。
26.权利要求24所述的方法，其中所述检测发生在每个所述温度脉冲中的所述第一高温和所述第二低温处。
27.权利要求24所述的方法，其中所述方法进一步包括: 识别具有从双链核酸至单链核酸分子的最大可检测的转换的温度脉冲。
28.权利要求27所述的方法，其中所述识别包括计算可检测的信号的差异，所述可检测的信号在单个温度脉冲内的所述第一高温和所述第二低温处测量。
29.权利要求23所述的方法，其中所述溶液包括多个双链核酸种类，每个所述种类包括不同的序列。
30.权利要求29所述的方法，其中每个所述多个双链核酸种类包括不同的解链温度。
31.权利要求23所述的方法，其中与单链核酸相比在存在双链核酸的情况下所述报道部分产生差别信号。
32.权利要求31所述的方法，其中所述差别信号是可逆的。
33.权利要求31所述的方法，其中所述报道部分包括荧光染料。
34.权利要求31所述的方法，其中所述报道部分选自:溴化乙锭、YO-PRO-1、Hoechst33258、Pico Green 和 SYBR Green。
35.权利要求23所述的方法，其中所述检测包括监测紫外线(UV)吸收。
36.权利要求23所述的方法，其中所述温度脉冲使用可编程的热循环仪产生。
37.一种确定关于核酸的双链至单链转换的动力学信息的方法，所述方法包括: 提供包括双链核酸分子和在存在双螺旋核酸的情况下具有特征可检测信号的报道部分的样品； 使所述样品经历一系列温度脉冲，其中所述脉冲引起所述双链核酸分子转换成单链分子并且转换回成双链分子；和 使用所述报道部分产生的信号检测在单链和双链状态之间的转换比，从而在所述状态之间的所述转换比提供关于所述转换的动力学信息。
38.一种确定双 螺旋核酸分子的解链温度的方法，所述方法包括 使包括多个单链核酸分子的溶液经历方波温度梯度，所述梯度包括引起所述单链核酸分子至双链核酸分子的至少一种转换的温度范围；和 在所述方波温度梯度的过程中检测所述至少一种转换。
39.权利要求38所述的方法，其中所述方波温度梯度包括一系列温度脉冲，每个脉冲包括: a)使所述溶液的温度升高至第一高温； b)使所述溶液的温度下降至第二低温； 其中所述第一高温高于所述第二低温；和 其中，在随后的脉冲中，将每个所述第一高温和所述第二低温调节至分别低于先前脉冲中的所述第一和第二温度。
40.权利要求39所述的方法，其中至少一个所述温度脉冲包括在所述双链核酸分子和所述单链核酸分子之间发生可检测的转换的温度范围。
41.一种确定双螺旋核酸分子的解链温度的方法，所述方法包括 使包括单链核酸分子的溶液经历方波温度梯度，所述梯度包括引起所述单链核酸分子至双链核酸分子的至少一种转换的温度范围；和 在所述方波温度梯度的过程中检测所述至少一种转换。
42.权利要求41所述的方法，其中所述方波温度梯度包括一系列温度脉冲，每个脉冲包括: a)使所述溶液的温度升高至第一高温； b)使所述溶液的温度下降至第二低温； 其中所述第一高温高于所述第二低温；和 其中，在随后的脉冲中，将每个所述第一高温和所述第二低温调节至分别低于先前脉冲中的所述第一和第二温度。
43.权利要求42所述的方法，其中至少一个所述温度脉冲包括在所述单链核酸分子和所述双链核酸分子之间发生可检测的转换的温度范围。
44.权利要求42所述的方法，其中所述检测发生在每个所述温度脉冲中的所述第一高温和所述第二低温处。
45.权利要求42所述的方法，其中所述方法进一步包括: 识别具有从单链核酸至双链核酸分子的最大可检测的转换的温度脉冲。
46.权利要求45所述的方法，其中所述识别包括计算可检测的信号的差异，所述可检测的信号在单个温度脉冲内所述第一高温和所述第二低温处测量。
【文档编号】G01N21/64GK103998921SQ201280061086
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年10月11日 优先权日:2011年10月14日
【发明者】A·斯蒂尔 申请人:贝克顿·迪金森公司