专利名称：一种荧光检测二价铜离子的方法
技术领域：
:本发明涉及二价铜离子的检测分析技术，具体属于一种基于1，8- 二氨基萘(DAN)荧光定量检测Cu2+的方法。
背景技术：
:作为酶的辅因子，信号使者，铜在生物体系中扮演着许多重要的角色。但高浓度的游离的二价铜离子会产生有害的效应，包括氧化损伤或引起蛋白质错误折叠致使许多神经变性疾病，神经性病变包括门克斯和威尔逊疾病、阿尔茨海默氏症、肌萎缩性侧索硬化症、朊毒体病。尤其是，在高浓度的二价铜离子存在下，由于在酶催化反应中铜离子取代其他金属离子作为辅因子，短期接触能引起胃肠紊乱；长期接触，会引起肝或肾不适。监测生理过程中二价铜离子的浓度和亚细胞分布的生理过程中铜的浓度，大大有助于理解它的化合物生理功能和致病原理。同时，铜离子已经被认定为一种环境污染物，并引起人们的关注。准确检测二价铜离子，在环境和生物分析等领域有重要意义。而发展高选择性、高灵敏度的二价铜离子的检测方法仍是一个挑战性的任务
发明内容
:本发明的目的是提供一种低成本、高灵敏、高选择性、在水相中荧光检测二价铜离子的方法。本发明将商业可得的1，8_ 二氨基萘作为荧光试剂，在检测二价铜离子中应用。1，8-二氨基萘的结构式为:
NH2 NH2本发明提供的一种检测二价铜离子的方法，步骤为:(I)、配制pH=7.0、浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的DAN乙醇溶液；(2)、按体积比2000:1将HEPES缓冲溶液和DAN乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，435nm的荧光强度逐渐减弱；(3)、用蒸馏水配制2mM的Cu2+溶液，把2mL的HEPES缓冲溶液和I μ L的DAN乙醇溶液加到荧光比色皿中，逐渐加入Cu2+溶液的体积为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5uL，同时在荧光光谱仪上测定435nm的对应的荧光强度F为529、490、469、422、400、373、335、305,236,以Cu2+浓度为横坐标，以相对荧光强度Ftl-F(F。= 570)为纵坐标绘制图，得到Cu2+浓度的工作曲线；线性回归方程为=Ftl-F=I0.9+64.0c (c的单位为10_6mol/L)；(4)、将HEPES缓冲溶液2000uL和1，8_ 二氨基萘乙醇溶液IuL加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取V ul待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入步骤(3)的线性回归方程，得到浓度C，待测样品Cit测样=2000uLXcX 1(T6/VuL，即可求得Cu2+的浓度。经实验证明，其它金属离子不干扰体系对Cu2+的测定。与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果:1、检测体系成本低廉，试剂商业可得且廉价；2、本发明的检测方法，对Cu2+显示了高的灵敏性和选择性；3、检测过程在水相中进行；4、检测手段简单，只需要借荧光光谱仪；5、本发明可用于细胞成像。
:图1实施例1DAN与Cu2+作用的荧光发射图。图2实施例2DAN与各种阳离子作用的荧光柱状图及颜色对照图。图3实施例3工作曲线图。图4实施例4细胞成像图。
具体实施方式
:实施例1配制pH=7.0、浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的DAN溶液；把2mL的HEPES缓冲溶液及I μ L的DAN乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，取Cu2+的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着Cu2+的加入，435nm处荧光强度逐渐减弱。荧光发射图见图1。实施例2配制pH=7.0、浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的DAN溶液；在25个荧光比色皿中，各加入2mL的HEPES缓冲溶液和I μ L的DAN乙醇溶液，再分别加入50摩尔当量的Cu2+，以及500摩尔当量的其他各种阳离子(Cu+，Ca2+，Fe2+，Zn2+，Ni2+，Bi3+，Co2+，V02+，Mn2+, Ru3+, Cd2+, Pb2+, Ag+, La3+, Ce4+, Yb3+, Cr2+, Er3+, Sn2+，Nd3+, Zr4+, Pd2+, Fe3+, andEu3+)，在荧光分光光度仪上检测，绘制不同阳离子对应的435nm荧光强度的柱状图，得到荧光发射图(Cu2+使得DAN的荧光强度由570变到90左右，其它的离子基本没有引起DAN荧光强度的变化)见图2。经实验证明，其它阳离子不干扰体系对Cu2+的测定。实施例3用蒸馏水配制2mM的Cu2+溶液，把2mL的HEPES缓冲溶液和I μ L的DAN乙醇溶液加到荧光比色皿中，逐渐加入Cu2+溶液的体积为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5uL，同时在荧光光谱仪上测定435nm的对应的荧光强度F为529、490、469、422、400、373、335、305、236，以Cu2+浓度为横坐标，以相对荧光强度Ftl-F(Ftl = 570)为纵坐标绘制图，得到Cu2+浓度的工作曲线；线性回归方程为:FQ-F=10.9+64.0C(C=10-6mOl/L)；实施例4用乙醇配制2mM的DAN乙醇溶液；将DAN乙醇溶液加入肝癌细胞培养液中，使得其浓度为20 μ Μ,与肝癌细胞!fepG2在37° C下，反应30min，体系在荧光共聚焦成像仪下显示了强的蓝色荧光^fDAN乙醇溶液加入肝癌细胞培养液中，使得其浓度为20 μ M，与肝癌细胞H印G2在37° C下，反应30min，再加入外源的Cu2+，使其浓度为50 μ Μ，在37° C下，再反应30min，体系在荧光共聚焦成像仪下没有荧光发射；即先进入细胞的DAN与随后进入细胞的二价铜离子作用，使其荧光淬灭。图4为荧光共聚焦成像仪下与DAN作用后的细胞a (显示蓝色荧光)，以 及先与DAN作用再与外源的Cu2+作用的细胞b成像图(不显示荧光)。
权利要求
1.1,8- 二氨基萘作为荧光试剂在检测二价铜离子中的应用。
2.一种检测二价铜离子的方法:其特征在于，步骤为: (1)、配制pH=7.0、浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的1，8_ 二氨基萘乙醇溶液； (2)、按体积比2000:1将HEPES缓冲溶液和1，8_二氨基萘乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，435nm的荧光强度逐渐减弱； (3)、用蒸馏水配制2mM的Cu2+溶液，把2mL的HEPES缓冲溶液和Iμ L的1，8- 二氨基萘乙醇溶液加到荧光比色皿中，逐渐加入Cu2+溶液的体积为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5uL，同时在荧光光谱仪上测定435nm的对应的荧光强度F为529、490、469、422、400、373、.335、305、236，以Cu2+浓度为横坐标，以相对荧光强度Ftl-F为纵坐标绘制图，F。= 570，得到Cu2+浓度的工作曲线；线性回归方程为=Ftl-F=I0.9+64.0c, c的单位为10_6mOl/L ； (4)、将HEPES缓冲溶液2000uL和I，8-二氨基萘乙醇溶液IuL加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取V Ul待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入步骤(3)的线性回归方程，得到浓度C，待测样品Cit3w=2000uLXcX 1(T6/VuL，即可求得 Cu2+ 的浓度。
全文摘要
本发明提供了一种二价铜离子的荧光检测方法，具体地说是基于一种商业可得的1，8-二氨基萘(DAN)检测二价铜的方法。检测方法是以DAN为荧光探针，在pH为7.0的HEPES溶液中定量地检测二价铜离子的含量。该检测方法，对二价铜离子显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。
文档编号G01N21/64GK103163108SQ201310042739
公开日2013年6月19日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者阴彩霞, 霍方俊 申请人:山西大学