（一）技术领域
本发明涉及一种牛α-乳白蛋白定量检测试剂盒及其应用。
（二）
背景技术：
牛α-乳白蛋白（Bovineα-Lactalbumin）是由123个氨基酸残基组成的结构紧密的单体球蛋白，含有4个二硫键，结构相对稳定，平均分子量在14186.1243。牛α-乳白蛋白是必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源，它与母乳中的α-乳白蛋白的氨基酸组成具有76%的相似度。其主要生理作用是与金属离子具有较佳的结合能力，还含有丰富的色氨酸，有助于提高血液中复合胺的释放，促进神经发育，具有很好的营养价值。目前，市场上出现了大量添加牛α-乳白蛋白的婴幼儿配方奶粉，由于原料质量混杂、加工工艺不同等原因造成产品质量良莠不齐，但又没有建立准确有效的定量检测方法，其中主要原因是缺少用于准确定量测定的方法和必须的实验材料。
目前国内外用于牛α-乳白蛋白的检测方法仍以SDS-PAGE法为主，该法为半定量方法，不能进行准确定量，由于操作繁琐无法在一般实验室进行推广；有人提出了应用GPC-UV的检测方法，由于分辨力差而不能用于复杂基质或低含量的原料检测；任一平等建立了RPLC-ESI-MS测定婴幼儿配方中的牛α-乳白蛋白的方法，样品经直接提取，根据蛋白在电喷雾离子化条件下会产生多电荷离子的原理，采用选择离子扫描模式（SIR）进行检测，该法只限于试样中非变性的牛α-乳白蛋白定量的检测，而无法测定因加热而变性的牛α-乳白蛋白。随后张京顺等建立了酶解法与RPLC-ESI-MS/MS结合测定婴幼儿配方中的变性与非变性牛α-乳白蛋白同时定量的方法，此方法中采用合成肽段作为内标物进行内标法定量。经查询，至今为止还未发现应用同位素内标肽稀释法，结合RPLC-ESI-MS/MS测定乳与乳制品中热变性和非变性牛α-乳白蛋白的方法。
（三）
技术实现要素：
本发明目的是提供一种应用同位素内标肽稀释法，结合RPLC-ESI-MS/MS测定乳与乳制品中热变性和非变性牛α-乳白蛋白的试剂盒及其应用。
本发明采用的技术方案是：
一种牛α-乳白蛋白定量检测试剂盒，主要包括同位素标记牛α-乳白蛋白特异肽、同位素标记牛α-乳白蛋白内标物和牛α-乳白蛋白特异肽标准品，所述同位素标记牛α-乳白蛋白特异肽的氨基酸序列为：VGI*NYWL*AHK，其中I*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛α-乳白蛋白内标物的氨基酸序列为：VKKILDKVGI*NYWL*AHKALCSEKL，其中I*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述牛α-乳白蛋白特异肽的氨基酸序列为：VGINYWLAHK。本发明试剂盒的关键在于对特异肽和内标物进行同位素标记，试剂盒中的其他组分，可根据现有技术进行确定，例如参照CN102590413A中所用的试剂。
本发明试剂盒中，牛α-乳白蛋白特异肽（以下简称：特异肽）是指牛α-乳白蛋白经筛选酶解后所产生的肽段，通过研究发现VGINYWLAHK是牛α-乳白蛋白的特异肽段之一，经使用高分辨液相色谱串联质谱法检测鉴定结果表明：存在牛乳及其制品中的酪蛋白、β-乳球蛋白等其他蛋白质中不存在与该氨基酸序列一致的氨基酸序列和胰蛋白酶酶解肽段。该氨基酸序列是牛α-乳白蛋白经牛胰蛋白酶酶解后所特有的肽段（图2）。经化学合成、提纯后纯度可达99.0%以上，在本试剂盒中作为定量标准物质使用（图3）；
同位素标记牛α-乳白蛋白特异肽是一条依据牛α-乳白蛋白特异肽序列，经化学合成后的带有同位素标记氨基酸的特异肽段（以下简称：同位素特异肽）。其氨基酸序列为VGI*NYWL*AHK，其中I*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸，经合成、提纯后纯度可达97.0%以上，而且其中不存在特异肽。在本试剂盒中作为内标酶解后质谱标记物质使用（图4）；
同位素标记牛α-乳白蛋白内标是专门为定量测定而设计与合成的内标物（以下简称：同位素内标）。同位素内标物的氨基酸序列为VKKILDKVGI*NYWL*AHKALCSEKL，其中I*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸。该肽段具有与牛α-乳白蛋白同样的酶解效率，可获得等量的同位素特异肽，可以对样品中的牛α-乳白蛋白做准确定量。经合成、提纯后纯度可达97.0%以上，而且在测定过程中不产生特异肽。在本试剂盒中作为内标物质使用（图5）。
各种合成肽的质量控制方法。
建立高效液相色谱（HPLC）和高效液相四级杆时间飞行串联质谱联用（HPLC-Q-TOF）检测方法对乳白蛋白特异肽，同位素特异肽，和同位素内标进行纯度与杂质鉴定。
①应用HPLC检测合成肽的纯度
称取肽段1mg，加入1mL水溶解，用水再将溶解液稀释5倍，用HPLC-UV法在220nm波长下进行检测，面积归一法计算纯度。
②应用HPLC-Q-TOF检测合成肽的杂质
称取肽段1mg，加入1mL水溶解，用水再将溶解液稀释20倍，用HPLC-Q-TOF法进行检测，通过全扫描以质量数的差异来鉴别杂质。
其中液相色谱分离条件如下：色谱柱：C18（孔径）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.08%（v/v）的三氟乙酸水溶液，流动相B为含0.08%（v/v）的三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。
其中质谱检测条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0，全扫描质量数区间200-2000m/z，停留时间100ms。
具体的，所述试剂盒中还可包括：NH4HCO3溶液（使用浓度500mmol/L），DTT溶液（使用浓度500mmol/L），IAA溶液（使用浓度500mmol/L），CaCl2溶液（使用浓度100mmol/L），胰蛋白酶溶液（使用浓度200μg/mL），以及甲酸。
本发明还涉及所述的试剂盒在定量检测乳或乳制品中牛α-乳白蛋白含量中的应用。
乳或乳制品中α-乳白蛋白的测定方法：
本发明适用于各种含量的牛α-乳白蛋白样品的定量检测，原料包括浓缩乳清粉、α-10乳清蛋白粉、脱盐乳清粉、生鲜乳等；产品包括婴幼儿配方粉、脱脂乳粉、全脂乳粉、高温杀菌奶、巴氏消毒奶、发酵型酸奶等。样品加入同位素内标后经胰蛋白酶酶切等样品前处理后，通过液相色谱分离，进入串联四级杆质谱，采用多反应监测方法进行检测，内标法计算结果。
所述样品前处理过程如下：称取待测样品适量，用温水溶解并稀释至总蛋白浓度约为1mg/mL，待冷却至室温，准确吸取500μL样品溶液，加入100μL20μmol/L同位素内标和400μL500mmol/LNH4HCO3溶液混匀，加入10μL500mmol/LDTT溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/LIAA溶液，暗处静置30min，加入10μL100mmol/LCaCl2溶液和40μL200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入20μL纯甲酸，室温静置1h，最后将酶解液定容至5mL，然后将所得溶液过0.22μm微孔滤膜后进样分析。
所述液相色谱分离参考条件如下：色谱柱：C18（孔径）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.1%（v/V）的甲酸水溶液，流动相B为含0.1%（v/V）甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。
所述质谱检测参考条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。
所述质谱多反应监测方法的参数参考条件如下：牛α-乳白蛋白特异肽的氨基酸序列为VGINYWLAHK，其双电荷质荷比为601.2m/z，它的两个特征碎片离子分别为355.4m/z和284.4m/z，对应的碰撞能量分别为24eV和28eV；同位素特异肽的氨基酸序列为VGI*NYWL*AHK（其中I*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸），其双电荷质荷比为608.4m/z，它的两个特征碎片离子分别为355.4m/z和284.3m/z，对应的碰撞能量分别为24eV和26eV。
所述内标法计算过程如下：用牛α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽配制成系列浓度的标准工作曲线溶液，与酶解后的样品溶液在相同的液相色谱质谱条件下进行分离检测，根据得到的标准工作曲线中牛α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的溶液浓度，进行线性回归，得出线性方程Y＝kX+b，其中Y为牛α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；X为牛α-乳白蛋白特异肽的浓度，单位为nmol/L；k为线性方程的斜率；b为线性方程的截距。将酶解后样品溶液中测得的牛α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比代入线性方程，即可计算得到样液中牛α-乳白蛋白特异肽的浓度，将此浓度代入含量计算公式Cx=na×M×N×10-10，即可得到被测样品中牛α-乳白蛋白的含量Cx。公式中Cx为被测样品中牛α-乳白蛋白的含量，单位为g/100g；na为被测样液中牛α-乳白蛋白特异肽的浓度的值；M为牛α-乳白蛋白的分子量的值，为14178；N为样品稀释倍数。
本发明利用胰蛋白酶只作用于精氨酸（R）和赖氨酸（K）的专一性，把乳清蛋白酶切成分子量从几十至上千道尔顿的肽段分子，从中选择只有牛α-乳白蛋白所特有的特征肽段分子（特异肽）作为定性目标，高纯度合成特异肽为定量标准品，同位素稀释串联质谱法进行酶解、色谱和质谱全程的定量。
本发明采用的装置为：高效液相串联四级杆质谱联用仪，高效液相四级杆时间飞行串联质谱，配备相应的控制软件，恒温水浴摇床或恒温箱，蛋白质序列合成仪，微量移液器。
本发明的有益效果主要体现在：
1、本发明试剂盒，配制齐全，通过试剂配制指南可操作简便地完成试剂配制，且易在一般实验室推广应用；
2、先进可靠的质量检测和控制方法，保证了试剂盒的质量和检测结果的重现性；可满足大批量样品检测的需求。
3、本发明所开发的方法使用经研究设计合成的同位素标记内标物，能够更为准确的对牛乳、配方粉及天然原料中的牛α-乳白蛋白进行定量，保证了结果的可靠性。
4、本发明可用于同时检测样品中非变性和热变性的牛α-乳白蛋白。
5、本发明所使用的试剂用量较少，检测成本较低，本试剂盒检测成本为每个试样28元人民币。
（四）附图说明
图1为本发明试剂盒所涉及的核心试剂整体外观照片；
图2为牛α-乳白蛋白特异肽在牛α-乳白蛋白一级结构中的位置及氨基酸序列图；
图3为本发明中所选牛α-乳白蛋白特异肽色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；
图4为本发明中所选同位素特异肽的色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；
图5为本发明中所选同位素内标的色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；
图6为本发明中所选同位素特异肽与文献中的非同位素内标特征肽以及牛α-乳白蛋白特异肽的线性比较图；
图7为本发明中所选同位素特异肽与文献中的非同位素内标特征肽以及牛α-乳白蛋白特异肽在不同基质中的基质效应比较图；
图8为本发明中所选同位素内标与文献中的非同位素内标以及牛α-乳白蛋白的酶解效率比较图。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1．本发明同位素特异肽的设计与确定：
根据实验确定的牛α-乳白蛋白特异肽的氨基酸序列，充分考虑其相关理化性质以及在质谱检测过程中的干扰与离子化效率问题，并兼顾实际生产应用的成本与可行性，引入稳定同位素标记的异亮氨酸（I*）和亮氨酸（L*）设计合成了牛α-乳白蛋白特异肽的同位素特异肽，其氨基酸序列为VGI*NYWL*AHK。
保留时间、线性和基质效应等要素在一定程度上可反映被测物质的色谱分离和质谱离子化效率，为了验证本发明所设计的同位素特异肽与牛α-乳白蛋白特异肽，在色谱分离和质谱离子化过程中的行为是否最大程度上相近，实验设计比较了本发明中的同位素特异肽、牛α-乳白蛋白特异肽和CN102590413A中使用的非同位素特征肽，在相同色质谱条件下的保留时间、线性及其在不同基质中的基质效应。分别配制相同浓度的本发明中的同位素特异肽、牛α-乳白蛋白特异肽和CN102590413A中使用的非同位素特异肽，以及这三者的标准系列工作溶液，在相同的色谱质谱条件下进样分析，得三者的保留时间与线性回归方程（附图6）。其中本发明中同位素特异肽和牛α-乳白蛋白特异肽的保留时间一致，分别为3.71min，而CN102590413A中使用的非同位素特征肽的保留时间为3.52min，由此可见本发明中同位素特异肽和牛α-乳白蛋白特异肽具有更相近的色谱行为。三者的线性回归方程分别为Y＝4.96X-25.8，Y＝5.04X+23.2和Y＝6.74X+50.8，由图6可见本发明中同位素特异肽和牛α-乳白蛋白特异肽的线性更加相近，说明二者在相同浓度时的信号响应更相近，从而也表明二者在质谱中的离子化、碰撞碎裂等过程中具有更加相近的质谱行为表现。为了进一步验证三者的质谱行为差异，比较了三者在鲜牛奶、乳酸奶、配方奶粉、全脂奶粉、脱脂奶粉、浓缩乳清粉等不同基质中的基质效应（附图7），结果表明在不同基质中本发明的同位素特异肽在最大程度上保持了与牛α-乳白蛋白特异肽一致的质谱行为。
2．本发明同位素内标的设计与确定：
在配方食品等复杂基质样品中，蛋白的酶解过程存在众多的影响因素，可能影响蛋白的酶解效率，为消除这些不确定因素对定量结果带来的影响，在已设计选择并验证确定的同位素特异肽的基础上，充分考虑保留酶解位点的完整性并兼顾实际生产应用的成本与可行性，引入稳定同位素标记的异亮氨酸（I*）和亮氨酸（L*）设计合成了同位素内标，其氨基酸序列为VKKILDKVGI*NYWL*AHKALCSEKL，该同位素内标经碱性胰蛋白酶酶解后可产生同位素特异肽VGI*NYWL*AHK。
为了验证本发明中的同位素内标与牛α-乳白蛋白是否具有更加相近的酶解效率，设计进行了如下实验：
取空白溶剂、鲜牛奶、乳酸奶、配方奶粉、全脂奶粉、脱脂奶粉、浓缩乳清粉等不同基质按要求配制成蛋白质总含量不大于1mg/ml的溶液；将牛α-乳白蛋白、本发明的同位素内标和CN102590413A中使用的非同位素内标配制成均含25μmol/L的混合标准溶液，准确吸取各基质溶液500μL，加入100μL混合标准溶液和400μLNH4CO3溶液，加入10μL500mmol/LDTT溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/LIAA溶液，暗处静置30min，加入10μL100mmol/LCaCl2溶液和40μL200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入20μL纯甲酸，室温静置1h，最后将酶解液定容至5mL，然后过0.22μm微孔滤膜得到理论浓度为500nmol/L的各物质对应的特异肽；另外取牛α-乳白蛋白特异肽、本发明的同位素特异肽和CN102590413A中使用的非同位素内标特征肽分别配制成500nmol/L的标准溶液，在相同的色谱质谱条件下进行检测分析，将各物质酶解后测得的对应特异肽浓度与理论浓度进行比较，计算得到不同基质中对应物质的酶解效率（附图8）。由图8可知，在不同样品基质中，本发明的同位素内标相较于非同位素内标而言，具有与牛α-乳白蛋白更为相近的酶解效率，因此本发明试剂盒与CN102590413A相比检测结果更为精确。
实施例2：试剂盒配制及使用说明
一、试剂配制：
1、牛α-乳白蛋白特异肽标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质1管中，超声溶解（30s），所得溶液即为500μmol/L的α-乳白蛋白特异肽标准储备液；
2、同位素特异肽标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质2管中，超声溶解（30s），所得溶液即为500μmol/L的同位素特异肽标准储备液；
3、同位素内标标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质3管中，超声溶解（30s），所得溶液即为500μmol/L的同位素内标标准储备液；
4、牛胰蛋白酶溶液的配制：准确移取10mL1.0%乙酸水溶液，加入试剂1管中（该管内装有已预先准确称量的牛胰蛋白酶，来源于牛胰腺，活力>10000BAEEunits），经超声溶解（30s），所得溶液即为200μg/mL的牛胰蛋白酶溶液；
5、碳酸氢铵溶液（NH4HCO3）的配制：准确称取3.95g试剂2于100mL容量瓶中，加入超纯水超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为500mmol/L的碳酸氢铵溶液；
6、碘代乙酰胺（IAA）溶液的配制：准确称取0.925g试剂3于10mL容量瓶中，加入500mmol/L的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为500mmol/L的碘代乙酰胺溶液；
7、二硫苏糖醇（DTT）溶液的配制：准确称取0.7712g试剂4于10mL容量瓶中，加入500mmol/L的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为500mmol/L的二硫苏糖醇溶液；
8、氯化钙（CaCl2）溶液的配制：准确称取0.111g试剂5于10mL容量瓶中，加入超纯水约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为100mmol/L的氯化钙溶液。
二、样品前处理及分析：
称取待测样品适量，用温水溶解并稀释至总蛋白浓度约为1mg/mL，待冷却至室温，准确吸取500μL样品溶液，加入100μL20μmol/L同位素内标和400μL500mmol/LNH4HCO3溶液混匀，加入10μL500mmol/LDTT溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/LIAA溶液，暗处静置30min，加入10μL100mmol/LCaCl2溶液和40μL200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入20μL纯甲酸，室温静置1h，最后将酶解液定容至5mL，然后将所得溶液过0.22μm微孔滤膜后进样分析。
液相色谱分离条件如下：色谱柱：C18（孔径）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.1%（v/v）的甲酸水溶液，流动相B为含0.1%（v/V）甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。
质谱检测条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。
质谱多反应监测方法的参数参考条件如下：牛α-乳白蛋白特异肽的氨基酸序列为VGINYWLAHK，其双电荷质荷比为601.2m/z，它的两个特征碎片离子分别为355.4m/z和284.4m/z，对应的碰撞能量分别为24eV和28eV；同位素特异肽的氨基酸序列为VGI*NYWL*AHK（其中I*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸），其双电荷质荷比为608.4m/z，它的两个特征碎片离子分别为355.4m/z和284.3m/z，对应的碰撞能量分别为24eV和26eV。
内标法计算过程如下：用牛α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽配制成系列浓度的标准工作曲线溶液，与酶解后的样品溶液在相同的液相色谱质谱条件下进行分离检测，根据得到的标准工作曲线中牛α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的溶液浓度，进行线性回归，得出线性方程Y＝kX+b，其中Y为牛α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；X为牛α-乳白蛋白特异肽的浓度，单位为nmol/L；k为线性方程的斜率；b为线性方程的截距。将酶解后样品溶液中测得的牛α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比代入线性方程，即可计算得到样液中牛α-乳白蛋白特异肽的浓度，将此浓度代入含量计算公式Cx=na×M×N×10-10,即可得到被测样品中牛α-乳白蛋白的含量Cx。公式中Cx为被测样品中牛α-乳白蛋白的含量，单位为g/100g；na为被测样液中牛α-乳白蛋白特异肽的浓度的值；M为牛α-乳白蛋白的分子量的值，为14178；N为样品稀释倍数。
实施例3：
样品类型：市售婴幼儿配方奶粉。
称样品0.5g于100mL容量瓶中，加温水溶解，待冷却至室温加水定容至刻度，准确吸取500μL，加入100μL20μmol/L同位素内标和400μL500mmol/LNH4HCO3溶液，加入10μL500mmol/LDTT溶液，50℃恒温反应30分钟，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/LIAA溶液，暗处静置30分钟，加入10μL100mmol/LCaCl2溶液和40μL200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入20μL纯甲酸，室温静置1小时，最后将酶解液定容至5mL，取所得样液按照实施例2方法进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛α-乳白蛋白的含量为1.69g/100g，产品包装标注为1.70g/100g。
实施例4：
样品类型：α-乳白蛋白原料。
称样品1.0g于100mL容量瓶中，加温水溶解，待冷却至室温加水定容至刻度，将样液稀释10倍后，再准确吸取500μL，加入100μL20μmol/L同位素内标和400μL500mmol/LNH4HCO3溶液，加入10μL500mmol/LDTT溶液，50℃恒温反应30分钟，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/LIAA溶液，暗处静置30分钟，加入10μL100mmol/LCaCl2溶液和40μL200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入20μL纯甲酸，室温静置1小时，最后将酶解液定容至5mL，取所得样液按照实施例2方法进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛α-乳白蛋白的含量为35.62g/100g，产品包装标注为α-乳白蛋白大于35g/100g。
实施例5：
样品类型：生鲜牛乳。
称样品2.0g于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，准确吸取500μL，加入100μL20μmol/L同位素内标和400μL500mmol/LNH4HCO3溶液，加入10μL500mmol/LDTT溶液，50℃恒温反应30分钟，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/LIAA溶液，暗室静置30分钟，加入10μL100mmol/LCaCl2溶液和40μL200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入20μL纯甲酸，室温静置1小时，最后将酶解液定容至5mL，取所得样液按照实施例2方法进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛α-乳白蛋白的含量为0.92g/100g。
本发明试剂盒的牛α-乳白蛋白定量检测方法的特点：定量限：0.001g/100g，重现性：RSD<5.1%（n=11），回收率：99.1~100.6%（n=6），试样预处理简单、快速、低成本，以及适用范围广阔。可对各类试样中常量和微量的非变性和热变性的牛α-乳白蛋白进行同时准确定量。