专利名称：快速分析肉桂叶片中精油含量和质量的组织整体观察方法
技术领域：
本发明属于肉桂的采收标准和鉴定技术领域，具体涉及一种快速分析肉桂叶片中精油含量和质量的植物组织整体观察方法。
背景技术：
肉桂主要的有效成分是挥发油，而挥发油中的主要成分是肉桂醛。肉桂不但树皮中含有大量的挥发油，其叶片中挥发油含量也很高。研究表明肉桂叶片中挥发油成分与树皮中的相似，同样可作为肉桂挥发油的原料。目前，生产上通常直接采收不同生长年限的叶片混合提取挥发油，此方式简单且可获得更高的叶原料和挥发油产量，但是，由于植物的幼叶与成熟叶的比例不同，精油成分混杂，导致精油的质量显著下降，这些因素直接影响了精油品质和市场价值，甚至影响到国际市场的出口量。目前，肉桂叶片的采收还没有明确的标准，更缺乏高品质原材料的有效鉴定方法。显微鉴别一直是中药真实性鉴定简便而有效的手段，结合仪器分析技术使得其更具有简单、科学的生产实践价值。目前，有研究报道利用组织透明法可观察植物油细胞形态并计算其密度，但是此方法并不能清楚地观察到油细胞形态的动态变化过程，无法区分油细胞中是否有精油形成、积累或已降解，因此，无法判断和统计油细胞发育状态与挥发油含量和质量的关系。目前，上述的组织透明法主要运用在植物生殖生物学和植物分类学等领域，还没有运用到药用植物质量鉴定等实际生产应用中，更缺少相关的肉桂叶片合理采收的有效鉴定方法。
发明内容
由于肉桂叶片的油细胞在石蜡制片或半薄制片中只能切到一个面，不具备代表性，而且在制片过程中精油往往被提取而影响对油细胞的观察，而常规植物组织透明法不能清晰地观察到整个油细胞。为了克服这些缺点与不足，本发明的目的在于提供一种快速分析肉桂叶片中精油含量和质量的植物组织整体观察方法，该方法是在气相-质谱联用(GC-MS)分析和红外光谱(FTIR)分析肉桂挥发油有效成分的基础上，利用改良后的植物组织透明法加上显微鉴定，对肉桂挥发油产生和积累的主要部位一油细胞进行观察，通过观察精油在油细胞中的积累程度来判断和确定肉桂植物叶片含挥发油的质量，为肉桂合理采收利用和高品质挥发油提取提供一种更合理、更可靠和更准确的方法。本发明的目的通过下述技术方案实现:—种快速分析肉桂叶片中精油含量和质量的植物组织整体观察方法，包括以下步骤:(I)采收肉桂叶片，然后用水清洗；(2)取叶片中部，切成小块，放进离析液中，渗溃2-10天，直至浸溃后离析液不再混浊；前3天每天更换1-2次离析液，如果浸溃后离析液是浑浊的，则要加大更换离析液的次数，直至离析液变澄清；采收后的新鲜叶片不能长时间搁置，应当马上清洗然后投入离析液中，以免对样品造成破坏、损伤；(3)经过步骤(2)的处理之后，叶片小块变得透明；将透明的叶片小块用蒸馏水冲洗干净，然后用过氧化氢溶液漂白，最后再用蒸馏水冲洗干净；(4)将叶片的下表皮撕去，然后置于载玻片上，下表面朝上，无需染色，用蒸馏水封片即可，运用显微拍照系统对材料进行观察、拍照、计算油细胞数目；(5)油细胞总密度达到5.50个/mm2以上的，以及处于饱和期的油细胞的密度达到
2.00个/mm2以上的叶片可作为精油高含量高质量的样品，可作为挥发油提取的原料；所述的密度值会因为不同种属的植物而有所不同。步骤(2)所述的小块优选长宽为IcmX Icm的小块；步骤(2)所述的离析液是质量体积比为5-8%的NaOH水溶液；步骤(2)所述的浸溃是在室温下浸溃或者在60°C的温箱中渗溃；步骤(3)所述的用过氧化氢溶液漂白，优选将透明的叶片小块置于过氧化氢溶液中浸溃5-10分钟；步骤(5)所述的处于饱和期的油细胞，其中精油产生已经非常少，仅有少量的小油滴融合到大油滴中(图ld，1)，甚至精油不再产生、积累，油细胞内呈现一个金黄色圆形的大油滴，油滴的体积达到最大，呈饱和状态(图1d, 2)。本发明的原理是:精油是肉桂叶片主要的有效成分。精油主要积累在油细胞中，因此油细胞的发育特性是决定精油产量和质量的关键部位。利用氢氧化钠组织透明法可将细胞壁以内的物质和色素溶去，使整块叶片材料变得透明，显示出其内部的结构。但由于油细胞的壁增厚，且木栓质化，叶片下表皮会影响油细胞的观察，因此若利用常规的组织透明法，只能观察到油细胞呈一个小黑点或小黄点，而本发明的改良后的组织透明方法，不仅可以保全完整的油细胞，还可以清晰地观察到精油在油细胞中积累的原始状态。本发明主要通过观察肉桂叶片油细胞发育特性和精油积累规律来判断肉桂植物挥发油质量，从形态组织学以及显微鉴定对高质量肉桂叶片进行采收。本发明基于不同年龄叶油细胞中挥发油积累变化的特征将油细胞发育过程分为五个阶段:无精油期、精油形成期、精油积累期、精油饱和期和精油解体期。采用本发明方法对肉桂叶片进行观察，发现肉桂叶片的质量主要是由其叶片中油细胞密度和饱和期油细胞所占比例决定的。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:1、本发明的方法主要是基于对挥发油产生和积累的主要部位一油细胞结构上进行研究，这种鉴定方法更具可靠性和准确性，克服了现有的常规组织透明法研究植物油细胞只能观察到油细胞一个轮廓，并不能清楚地观察到油细胞中精油积累的动态变化的缺点。2、本发明的方法不仅能清楚地观察到油细胞分布和形状，而且能清楚地显示出各个时期油细胞中精油的形态变化和积累特征。3、本发明的方法处理时间短，操作简单，不需要复杂设备和众多的药品。无需进行挥发油提取和化学成分测定就能判断肉桂叶片质量的好坏，为肉桂叶片以及其他含油植物的合理采收利用提供一种简便、真实和准确的方法。如果种植地远离实验室时，可以在种植地进行即时就地的透明处理。
图1是肉桂叶片油细胞中精油的动态变化过程示意图；其中，a_无精油期，b_精油形成期，C-精油积累期，d-精油饱和期，e-精油解体期。图2是不同发育阶段的中国肉桂叶片挥发油含量示意图。图3是不同发育阶段的中国肉桂叶片油细胞总密度与精油积累期+饱和期油细胞密度示意图。图4是不同发育阶段的中国肉桂叶片反式肉桂醛含量示意图。图5是肉桂I年生枝条上的第I和第2叶油细胞分布及精油积累情况示意图；其中，1-1年生枝条上的第I叶，2-1年生枝条上的第2叶。图6是肉桂I年生枝条上的第3和第4叶油细胞分布及精油积累情况示意图；其中，1-1年生枝条上的第3叶，2-1年生枝条上的第4叶。图7是肉桂I年生枝条上的第5和第6叶油细胞分布及精油积累情况示意图；其中，1-1年生枝条上的第5叶，2-1年生枝条上的第6叶。图8是肉桂2年生、3年生、4年生枝条上的叶片油细胞分布及精油积累情况示意图；其中，1-2年生枝条上的叶片，2-3年生枝条上的叶片，3-4年生枝条上的叶片。图9是用本发明的方法和常规透明法处理肉桂叶片后油细胞的形态图；其中，1-对比例I的方法,2-实施例1的方法。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下所涉及的肉桂均是以中国肉桂的西江桂(Cinnamomum cassia Presl.)为例。肉桂叶片油细胞中精油的发育过程分为五个阶段:无精油期、精油形成期、精油积累期、精油饱和期和精油解体期，各时期的形态如图1所示:图a，第一阶段(无精油期):此阶段油细胞中还没有观察到精油产生，油细胞呈圆形。图b，第二阶段(精油形成期):此阶段精油开始慢慢形成、不断产生众多小油滴(图b, I),小油滴相互聚集,逐渐形成多个稍大的浅黄色油滴(图b, 2)和更大的金黄色圆形油滴(图 b，3)。图c，第三阶段(精油积累期):油滴进一步积累，并逐渐融合，形成一个大的中央油滴(图C，I),以后，由于油细胞中周围的小油滴继续加入，不断的融合到大油滴中(图C，2-3)，精油的体积也迅速增大，形成典型的中央大油滴(图C，1-3)。图d，第四阶段(精油饱和期):此后油细胞中精油产生不断减少，仅有少量的小油滴融合到大油滴中(图d，1)，甚至精油不再积累，这时精油形成一个金黄色圆形的大油滴，油滴的体积达到最大，呈饱和状态(图d，2)。图e，第五阶段(精油解体期):此期精油滴开始降解，逐渐转变为黑褐色(图e，1)，随后，整个油滴逐渐解体，慢慢裂开，颜色不断变深，呈黑墨色(图e，2)，最后无序地充满整个油细胞(图e，3-4)。为了验证肉桂叶片中油细胞发育阶段与肉桂精油含量之间的关系，对以下5个不同发育阶段的中国肉桂叶片样品利用水蒸气蒸馏法提取挥发油，以及对其挥发油进行了气相-质谱联用(GC-MS)分析和红外光谱(FTIR)分析，得到以下结果(见图2，3，4)，得出以下结论:I年生枝条上的1-4叶——油细胞总密度低，精油积累少，挥发油(1.01%)和肉桂醛含量(57.89%)低。I年生枝条上的5-6叶——油细胞总密度和饱和时期油细胞密度增多，挥发油(2.08%)和肉桂醛含量(61.62%)增加。2年生枝条上的叶片——油细胞总密度与饱和时期油细胞密度达到最高峰，挥发油(2.12%)和肉桂醛(66.47%)含量达到最大值。3年生枝条上的叶片——精油解体期油细胞密度增大，挥发油(1.45%)和肉桂醛(64.27%)含量又开始下降。4年生枝条上的叶片——精油解体越来越多，密度达到最大，挥发油含量(0.54%)急剧下降，肉桂醒含量(61.57%)也相对降低。可见，不同发育阶段的叶片中，油细胞密度以及饱和时期油细胞的密度与精油的含量和质量呈正相关，所以可以用油细胞密度以及饱和时期油细胞的密度作为衡量叶片中精油含量和质量的指标。实施例1一种快速分析肉桂叶片中精油含量的植物组织整体观察方法，包括以下步骤:(I)采收较幼嫩的新鲜中国肉桂叶片，用水清洗；(2)取叶片中部，切成长宽为IcmXlcm的小块，放入5% (质量体积比)的NaOH水溶液中，溶液量大约是叶片质量的50倍，在室温下渗溃24-48小时即可，期间更换3次以上NaOH水溶液，直至液体变澄清；(3)待组织变白透明后用蒸馏水冲洗干净，并用30%过氧化氢溶液漂白5分钟，然后再用蒸馏水冲洗干净；(4)用解剖针和镊子将叶片下表皮撕掉，将材料放在载玻片上，下表面朝上，用蒸馏水封片，在显微镜下观察、计数。如果生产条件简单或种植地远离实验室时，可将透明好的材料放在水中短期保存，备用。用此方法相当简捷方便，用材少，可节约原材料大大提高经济效益。实施例2—种快速分析肉桂叶片中精油含量的植物组织整体观察方法，包括以下步骤:(I)采收发育已经成熟的新鲜中国肉桂叶片，用水清洗；(2)取叶片中部，切成长宽为IcmX Icm的小块，由于肉桂叶片革质，发育成熟的叶片较厚难透明，可放在8% (质量体积比)的NaOH水溶液中，在60°C的温箱中渗溃，如溶液变浑浊，则不断更换溶液，直至液体变澄清，大约需10天左右；(3)待组织透明后用蒸馏水冲洗干净，并用30%过氧化氢溶液漂白10分钟，然后再用蒸馏水冲洗干净；
(4)用解剖针和镊子将叶片下表皮撕掉，放在载玻片上，下表皮面朝上，用蒸馏水封片，在显微镜下观察、计数。如果生产条件简单或种植地远离实验室时，可将透明好的材料放在水中短期保存，备用。用此方法相当简捷方便，用材少，可节约原材料大大提高经济效益。实施例3采收不同发育阶段的中国肉桂叶片，SPa:较幼嫩的I年生枝条上的第1-4叶，b:l年生枝条上的5-6叶，c:发育成熟的2年生枝条上的叶片d:3年生枝条上的叶片e:较老的4年生枝条上的叶片用实施例1的方法对这5样品进行处理观察。得出以下观察结果:由图5可以看出:1年生枝条上的叶片油细胞中虽无精油产生，但可以清楚地观察到油细胞并且能准确地计算其密度，还能观察到油细胞是怎么产生的。观察发现在I年生枝条上I叶和2叶已有油细胞出现，但是密度较低，分别为1.67个/mm2和2.69个/mm2(表1)，油细胞均处于无精油时期。由图6可以看出:在I年生枝条上的3和4叶中，油细胞密度迅速增加，分别达到
4.50个/mm2和5.63个/mm2 (表I);油细胞中精油开始产生并不断积累(图3)，处于精油积累期的油细胞数量最多(59.11和54.71%)(表1)，密度分别为2.66个/mm2和3.08个/mm2(表 I)。由图7可以看出:在I年生枝条上的5和6叶，精油进一步产生、积累，精油饱和期的油细胞数目不断增多(23.51和36.48%)(表I )，精油饱和期的油细胞密度也不断增大，分别为1.34个/mm2和2.28个/mm2 (表I)。叶片在此发育阶段，可以观察到精油有部分已开始降解，精油解体期的油细胞比例分别为1.93和3.20% (表1)，此时，可以同时观察到精油细胞发育的5个时期。由图8可以看出:在2年生枝条上叶片生长旺盛，油细胞密度达到最大值，为6.91个/mm2 (表1)，精油饱和期的油细胞数量达到顶峰，在5个时期中占的比例最高，高达48.05%，密度也达到了 3.32个/mm2 (表1);3年生和4年生枝条上的叶片随着叶片的成熟、变黄，精油解体期的油细胞不断增多，3年生枝条上的叶片精油解体期的油细胞数量明显增多(15.59%)(表I)。4年生枝条上的叶片精油解体期的油细胞最多，比例达到30.51%，密度为 1.62 个/mm2 (表 I)。不同发育阶段的中国肉桂叶片各时期油细胞密度统计比较结果见表I。由以上实验结果可以看出，随着叶的发育，各时期油细胞密度呈现规律性变化。精油形成期、积累期和饱和期的油细胞密度和总密度随着叶片发育成熟程度增加呈现先增加后减少趋势。精油形成期和积累期的油细胞以I年生枝条上的第4叶最多，精油饱和期的油细胞数量和油细胞总密度在2年生枝条上的叶片达到顶峰。而精油解体期则随着叶片发育成熟呈直线上升趋势，4年生枝条上的叶片精油解体最多(表I)。对比例I采收新鲜的中国肉桂叶片，用水清洗；然后用常规透明法(李正理编著.植物制片技术(第二版).科学出版社出版，1987，101.)进行处理、观察。由图9可以看出:常规组织透明法(对比例I)只能观察到油细胞一个轮廓，呈现一个小黄点或小黑点，并不能观察到油细胞中精油积累的动态变化特点。本发明的方法(实施例I)利用组织透明后撕下叶下表皮进行观察的方法，清楚地显示出各个油细胞中精油的形态变化和积累特征。表I
权利要求
1.一种快速分析肉桂叶片中精油含量和质量的植物组织整体观察方法，其特征在于包括以下步骤: (1)采收肉桂叶片，然后用水清洗； (2)取叶片中部，切成小块，放进离析液中，渗溃2-10天，直至浸溃后离析液不再混浊；前3天每天更换1-2次离析液，如果浸溃后离析液是浑浊的，则要加大更换离析液的次数，直至离析液变澄清； (3)经过步骤(2)的处理之后，叶片小块变得透明；将透明的叶片小块用蒸馏水冲洗干净，然后用过氧化氢溶液漂白，最后再用蒸馏水冲洗干净； (4)将叶片的下表皮撕去，然后置于载玻片上，下表面朝上，无需染色，用蒸馏水封片即可，运用显微拍照系统对材料进行观察、拍照、计算油细胞数目； (5)油细胞总密度达到5.50个/mm2以上的，以及处于饱和期的油细胞的密度达到2.00个/mm2以上的叶片可作为精油高含量高质量的样品，可作为挥发油提取的原料； 步骤(2)所述的离析液是质量体积比为5-8%的NaOH水溶液； 步骤(5)所述的处于饱和期的油细胞，其中不再产生精油，油细胞内呈现一个金黄色圆形的大油滴，油滴的体积达到最大，呈饱和状态。
2.根据权利要求1所述的快速分析肉桂叶片中精油含量和质量的植物组织整体观察方法，其特征在于:步骤(2)所述的浸溃是在室温下浸溃或者在60°C的温箱中渗溃。
3.根据权利要求1所述的快速分析肉桂叶片中精油含量和质量的植物组织整体观察方法，其特征在于:步骤(3)所述的用过氧化氢溶液漂白，是将透明的叶片小块置于过氧化氢溶液中浸溃5-10分钟。
全文摘要
本发明公开了一种快速分析肉桂叶片中精油含量和质量的植物组织整体观察方法，该方法包括以下步骤取叶片中部小块放进离析液中，渗渍2-10天；叶片小块变得透明；将透明的叶片小块用过氧化氢溶液漂白；将叶片的下表皮撕去，下表面朝上，用蒸馏水封片即可，运用显微拍照系统对材料进行观察、拍照、计算油细胞数目；油细胞总密度和处于饱和期的油细胞的密度高的叶片可作为精油高含量高质量的样品，可作为挥发油提取的原料。本发明的方法不仅能清楚地观察到油细胞分布和形状，而且能清楚地显示出各个时期油细胞中精油的形态变化和积累特征，更具可靠性和准确性，克服了现有的常规组织透明法研究植物油细胞只能观察到油细胞一个轮廓，并不能清楚地观察到油细胞中精油积累的动态变化的缺点。
文档编号G01N15/10GK103163060SQ201310071670
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月6日 优先权日2013年3月6日
发明者吴鸿, 李雁群 申请人:华南农业大学