专利名称：一种基于点击化学的便携式检测铜离子浓度的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于点击化学的便携式检测铜离子浓度的方法，属于分析化学领域。
背景技术：
铜是动物体内不可缺少的微量兀素(E.Merian, Metals and their compounds inthe environment, VCH, ffeinheim, 1991, p.893.), 1945 年Braude 提出饲料中添加 10 倍动物生理所需求剂量的铜具有促生长作用，能够明显改善动物的生长性能，因此铜成为了动物饲料必要添加剂之一。此外，铜还具有抑菌抗微生物的作用，增加饲料中的铜，可增强动物机体的免疫机能(周明荣，王金法，王宗元，邵科明，铜、锌、锰、硒对肉鸡生长性能和血液中某些生理生化指标等影响的研究，1993，24(5)，412-422.)，有利于抵抗微生物的侵袭。但是添加过量的铜又易引发一系列的中毒反应。如果人们食用了铜超标的肉类，会引起咳嗽，恶心，腹泻，还可能造成严重肾损害和溶血，甚至会出现黄疸、贫血、肝大、血红蛋白尿、急性肾功能衰竭等症状。
点击化学(Kolb,H.C.; Finn, M.G.; Sharpless, K.B., Click Chemistry:Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.Angew.Chem 2001, 40,2004-2021.)是在2001年由诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless首先提出的。点击化学具有模块化、可靠、高效率、高选择性、反应条件温和、产物收率高、副反应少、分离提纯简单等特点，被广泛应用于环境、化学及生物医学等众多领域。
目前检测铜的方法有原子吸收光谱法(Lemos, V.; Novaes, G.; de Carvalho,A.; Gama, E.; Santos, A., Determination of copper in biological samples by flameatomic absorption spectrometry after precipitation with Me-BTAP.EnvironmentalMonitoring and Assessment 2009, 148 (I), 245-253.； emberyova, M.; Bartekova,J.; Zavadska, M.; Sisolakova, M., Determination of bioavailable fractions ofZn, Cu, Ni, Pb and Cd in soils and sludges by atomic absorption spectrometry.Talanta 2007, 71 (4)，1661-1668.;邓世林，李新凤，郭小林.肝豆状核变性病人血清和尿中铜的测定及其临床意义.光谱学与光谱分析，2003，23 (3) ,576-578.)，X-射线突光光谱法(Gordeeva, V.P.; Statkus, M.A.; Tsysin, G.1.; Zolotov, Y.A., X-ray fluorescence determination of As, Bi, Co, Cu, Fe, Ni, Pb, Se, Vand Zn in natural water and soil extracts after preconcentration of theirpyrrolidinedithiocarbamates on cellulose filters.Talanta 2003, 61 (3)，315-329.)，电化学检测(赵会欣，李毅，蔡巍，郭红荪，王平，水环境痕量重金属检测的电化学传感器的研究.仪表技术和传感器，2009(6),158-161.;曾立平，许贺，刑苏洁，超声-伏安法对饮用水中痕过量铅和铜的检测研究.化学学报，2009, 67 (3)，225-230.)等。但是这些方法的一个普遍缺点是需要用到大型的仪器设备，这类仪器设备不但价格昂贵，操作复杂，而且不方便携带，无法实现现场检测。发明内容
本发明的目的在于提供一种基于点击化学的便携式检测铜离子浓度的方法，该方法以血糖仪为平台，能够便携的、快速、现场检测铜离子浓度。
本发明采取的技术方案如下: 一种基于点击化学的便携式检测铜离子浓度的方法，按照以下步骤进行: (1)根据文献Hermanson, G.T.Bioconjugate Techniques; Elsevier: London,2008中的方法制备浓度为0.3 μ M的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物； (2)将修饰有链霉亲和素的磁珠溶于由0.1M NaCU0.1M ρΗ=7.3的PBS、0.05%Tween-20组成的缓冲溶液中，加入0.3 μ M修饰有生物素的DNA，室温振荡30± I分钟，制备修饰在磁珠上的DNA化合物； (3)将步骤(I)与(2)制备的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物与修饰在磁珠上的DNA化合物以摩尔比1:1混合，加入待测样品和抗坏血酸钠，室温培育1.5±0.5小时； (4 )用磁铁分离步骤(3 )中的磁珠与混合溶液，用缓冲溶液洗涤磁珠三次，洗涤后的磁珠中加入10 μ L缓冲溶液，再加入20 μ L IM蔗糖溶液，于40°C反应15分钟； (5)用血糖仪配合血糖仪试纸测定步骤(4)反应后的溶液，记录数据； (6)以已知铜离子浓度为横坐标，其对应的血糖仪读数为纵坐标，绘制曲线，得到铜离子浓度和血糖仪读数的线性方程，然后根据待测样品的血糖仪读数，计算对应的铜离子浓度。
所述铜离子浓度和血糖仪读数的线性方程Y=0.86807+1.660281gX，其中Y为血糖仪读数，单位为mM ；X为其所对应的铜离子浓度，单位为PM。
步骤(I)中所述的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物的序列为从左到右5’到3’:炔基-TGTCCGTAGCTAAAAAAAAAAAAA-转化酶。
步骤(2)中所述的修饰有生物素的DNA的序列为从左到右5’到3’:生物素-AAAAAAAAAAAATCACAGATGAGTAGT-叠氮基。
步骤(3)中抗坏血酸钠的加入量为0.6mM。
上述方法可应用于人体血清样品中铜离子浓度的检测。
本发明具有操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好等优点。在I pM到316 pM的浓度范围内对铜离子的检测呈现良好的线性响应，检测限可达0.33 pM。
本发明的显著优点在于: (O 本发明的两种修饰DNA合成方法简单、快速、反应条件温和、容易控制，得到的DNA化合物具有良好的活性和稳定性。
(2)本发明的操作步骤简单、便捷、灵敏、成本低而且无毒害，实用性强。
(3)本发明在识别铜离子的过程中，能快速读取数值，有利于对铜离子的检测。
(4) 本发明的检测仪器为血糖仪，仪器小巧方便携带，操作简单快速，特别适用于现场检测。
图1为本发明对铜离子检测的响应曲线。(A)在不同铜离子浓度时所对应的血糖仪信号，从低到高分别为I ρΜ、3.16 PM、10 ρΜ、31.6 ρΜ、100 ρΜ和316 ρΜ; (B)从I到6为随着铜离子浓度的增加(1-316 PM)，其血糖试纸比色窗颜色的变化。
图2为本发明对铜离子检测的特异性。(A)从左到右为在不同干扰物质中所示的血糖仪信号，从左到右分别为铜离子、钾离子、钠离子、镁离子、银离子、钙离子、镍离子和铁离子；铜离子和所有干扰物质的浓度均为I ηΜ ； (B)在不同干扰物质中所示的血糖试纸比色窗颜色，从O到7分别为铜离子、钾离子、钠离子、镁离子、银离子、钙离子、镍离子和铁离子；铜离子和所有干扰物质的浓度均为I ηΜ。
具体实施方式
实施例1 1、修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物的合成。参考文献(Hermanson，G.T.Bioconjugate Techniques; Elsevier: London, 2008)。具体步骤如下: A、将30μ M修饰有巯基的DNA与60 μ M TCEP于PBS缓冲溶液中混合均匀，室温培育I小时； B、将11.30 mg/mL 蔗糖转化酶与 I mg Sulfo-SMCC 于缓冲溶液(0.1 M PBS, ΡΗ=7.3，0.1 M NaCl)中混合5min，室温下置于摇床上振动I小时，再将混合物离心分离，取上清液； C、将A与B制备的物质混合，室温下反应48小时。
2、修饰有蔗糖转化酶的磁珠的制备与铜离子的检测，具体步骤如下: (I)将修饰有链霉亲和素的磁珠溶于由0.1M NaCU0.1M PH=7.3的PBS、0.05%Tween-20组成的缓冲溶液中，加入0.3μΜ修饰有生物素的DNA，室温振荡(30± I)分钟。
(2)将步骤I与步骤2 (I)制备的0.3μ M修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物与0.3 μ M修饰在磁珠上的DNA化合物以摩尔比1:1混合均匀，加入含铜离子的待测样品(铜离子浓度从低到高分别为I PM,3.16 ρΜ、10 ρΜ、31.6 ρΜ、100 ρΜ和316 ρΜ)和0.6mM抗坏血酸钠，室温培育(1.5±0.05)小时，发生点击化学反应，生成三唑化合物。
(3)用磁铁分离步骤(2)中的磁珠与混合溶液，用由0.1M NaCU0.1M PH=7.3的PBS,0.05% Tween-20组成的缓冲溶液洗涤磁珠三次并向磁珠中加入该缓冲溶液10 μ L，再加入20yL I M蔗糖溶液，于40°C反应15分钟。
( 4 )用罗氏血糖仪测定步骤(3 )反应后的溶液，记录血糖仪读数。随着铜离子浓度的增加，其所对应的血糖仪信号也相应增强(血糖仪信号从低到高分别为0.9 mMU.6 mM、2.45 mM、3.4 mM、4.2 mM和5.3 mM。其对应的血糖试纸比色窗颜色变化依次如图1 (B)所示，从左至右，颜色依次由黄色转变为黄绿色再转变为绿色。以铜离子浓度为横坐标，其对应的血糖仪读数为纵坐标，绘制曲线(图1);得到铜离子浓度和血糖仪读数的线性方程Y=0.86807+1.660281gX，其中Y为血糖仪读数，单位为mM ；X为其所对应的铜离子浓度，单位为ρΜ。
实施例2 人血清中铜离子浓度的检测，具体步骤如下: 向0.3 μ M两种修饰的DNA混合物中加入0.6 mM抗坏血酸钠和稀释IO5倍的人血清样品，室温培育(1.5±0.05)小时，然后用磁铁分离混合物，用50 μ L缓冲溶液洗涤磁珠三次并加入10 μ L缓冲溶液，再加入20 μ L IM蔗糖溶液，于40°C反应15分钟，移取2.5 μ L用血糖仪测量，记录数据。根据实施例1中得到的铜离子浓度和血糖仪读数的线性方程Y=0.86807+1.660281gX，计算得到四组人血清样品中铜离子浓度分别为19.23 pM、16.74PM、16.74 pM、16.74 ρΜ、16.74 pM。
实施例3 为了检测本发明的特异性，将实施例1步骤2中所使用的铜离子换成其他干扰物质，分别为钾离子、钠离子、镁离子、银离子、钙离子、镍离子和铁离子，铜离子和其他干扰物质的浓度均为I ηΜ。如图2 (A)所示，从左到右为在不同干扰物质中所示的血糖仪信号，从左到右分别为铜离子(6.5 mM)、钾离子(1.1 mM)、钠离子(0.9 1111)、镁离子(1.4 mM)、银离子(1.8 mM)、钙离子(2.3禮)、镍离子(1.4 mM)和铁离子(1.7 mM)，其相对应的血糖试纸比色窗颜色变化如图2 (B)所示，从O到7分别为铜离子、钾离子、6.5钠离子、镁离子、银离子、钙离子、镍离子和铁离子，除了 O是明显的绿色，其余均为黄色。结果说明本发明所述方法对铜离子检测有较好的特异性。
权利要求
1.一种基于点击化学的便携式检测铜离子浓度的方法，其特征在于:按照以下步骤进行: (1)制备浓度为0.3 μ M的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物； (2)将修饰有链霉亲和素的磁珠溶于由0.1M NaCU0.1M ρΗ=7.3的PBS、0.05%Tween-20组成的缓冲溶液中，加入0.3 μ M修饰有生物素的DNA，室温振荡30± I分钟，制备修饰在磁珠上的DNA化合物； (3)将步骤(I)与(2)制备的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物与修饰在磁珠上的DNA化合物以摩尔比1:1混合,加入待测样品和抗坏血酸钠,室温培育1.5±0.5小时； (4)用磁铁分离步骤(3)中的磁珠与混合溶液，用缓冲溶液洗涤磁珠三次，洗涤后的磁珠中加入10 μ L缓冲溶液，再加入20 μ L IM蔗糖溶液，于40°C反应15分钟； (5)用血糖仪配合血糖仪试纸测定步骤(4)反应后的溶液，记录数据； (6)以已知铜离子浓度为横坐标，其对应的血糖仪读数为纵坐标，绘制曲线，得到铜离子浓度和血糖仪读数的线性方程，然后根据待测样品的血糖仪读数，计算对应的铜离子浓度。
2.根据权利要求1所述的基于点击化学的便携式检测铜离子浓度的方法，其特征在于步骤(I)中所述的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物的序列为从左到右5’到3’:炔基-TGTCCGTAGCTAAAAAAAAAAAAA-转化酶。
3.根据权利要求1所述的基于点击化学的便携式检测铜离子浓度的方法，其特征在于步骤(2)中所述的修饰有生物素的DNA的序列为从左到右5’到3’:生物素-AAAAAAAAAAAATCACAGATGAGTAGT-叠氮基。
4.根据权利要求1所述的基于点击化学的便携式检测铜离子浓度的方法，其特征在于步骤(3)中抗坏血酸钠的加入量为0.6mM。
5.根据权利要求1所述的基于点击化学的便携式检测铜离子浓度的方法，其特征在于:所述铜离子浓度和血糖仪读数的线性方程Y=0.86807+1.660281gX，其中Y为血糖仪读数，单位为mM ；X为其所对应的铜离子浓度,单位为PM。
全文摘要
本发明提供了一种基于点击化学的便携式检测铜离子浓度的方法，属于分析化学领域。在抗坏血酸钠还原二价铜为一价铜作为催化剂的条件下，使修饰有叠氮基与修饰有炔基的DNA发生1,3-偶极环加成反应，从而将修饰有蔗糖转化酶的DNA固定在磁珠上。通过分离磁珠与溶液，并将清洗后的磁珠溶于蔗糖溶液中进行酶解反应，再使用血糖仪测量酶解后的反应溶液，即可检测铜离子的浓度。该方法以血糖仪为平台，能够便携的、快速、现场检测铜离子浓度。可将该方法应用于人体血清样品中铜离子浓度的检测，本发明具有操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好等优点。
文档编号G01N21/78GK103163130SQ20131009592
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月25日 优先权日2013年3月25日
发明者林振宇, 周津, 陈国南, 郭隆华, 邱彬 申请人:福州大学