专利名称：黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法
技术领域：
本发明涉及微量有害物质物理检测的新方法，尤其涉及的是一种黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法。
背景技术：
黄曲霉素是食品安全检测中国家规定必检的一个项目，目前多采用生化的检测方法。这类检测方法都还存在着这样或那样的缺陷。如TLC方法虽然简便，但灵敏度差；HPLC虽然灵敏度高，但样品处理烦琐，操作复杂，仪器昂贵。ELISA重复性差试剂寿命短需要低温保存。在操作过程中，这类方法大多需要使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物，有对操作人员造成巨大沾污的危险。在对样品进行预处理过程中，需要使用多种有毒、异味的有机溶齐U，不仅毒害操作人员，而且污染环境。操作过程烦琐、时间长，劳动强度大。仪器设备复杂、笨重，难以实现现场快速分析。
发明内容
本发明是一种黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法，它采用了物理的检测方法，用于解决在黄曲霉素检测过程中遇到的上述问题。它不仅可以检测出被检物是否含有黄曲霉素，而且可以辨别黄曲霉素的种类，在检测的精确度上，不亚于ELISA方法，而检测过程却大大简化，检测耗时大大缩短。本发明的技术方案如下:将怀疑有黄曲霉菌感染的粮食、食品和食用油作为待检对象，并制作待检物的样品。利用黄曲霉毒素免疫亲和柱对待检物中含有的黄曲霉毒素进行提取。提取的黄曲霉毒素保存在非极性、易挥发的有机溶剂(如甲醇、氯仿)中，并低温、密封保存。检测时首先制作用于太赫兹波谱检测的样品。考虑到黄曲霉素检测浓度过低带来的不力影响，本技术方案采用了痕量检测方法。该方法的基本过程为:将含有黄曲霉素的溶剂滴到载玻片上，并涂抹均匀，然后让有机溶剂挥发，有机容易挥发完后就会在载玻片上留下一层黄曲霉毒素的薄层，考虑到薄层不均匀或过薄影响检测效果，可多滴几次，并使溶剂完全挥发，以增加薄层厚度，增强检测效果。载有黄曲霉毒素薄层的载玻片放在太赫兹时域波谱检测系统(THz-TDS)上采用透射法进行波谱测量，得到黄曲霉毒素的波谱。采用上述方法先获取各种已知黄曲霉毒素波谱，并作为知识存储到一个专家系统中。通过1-5步得到的待检样品的波谱，与存储在专家系统中的波谱进行比对或匹配，以判断是否有黄曲霉素和黄曲霉毒素的类型。将黄曲霉毒素的检测结果在计算机上输出，形成并打印检测报告。
有益效果:1.利用本技术发明对黄曲霉毒素进行检测，突出的优势是检测速度快。因为样品对太赫兹波的响应非常快，在纳秒量级，检测系统采集这种响应并采用计算机进行分析计算也在秒量级上。一般检测时为了提高准确性，需要进行多次检测(一般为三次)，并将检测结果取平均值，加上人工分析、给出结论的时间，一般不超过半个小时。而一般的生化检测的检测时间，多在数天至数小时时间不等，本技术发明大大缩短了检测时间。2.本技术发明采用计算机技术进行分析判断，具有比一般生化的检测方法更高的智能性。生化检测大多最后的判断还是需要人工的方法，智能化程度不高，而且受到检测人员经验的限制，往往会出现判断失误的情况。本技术发明通过计算机对采集的太赫兹波谱进行智能分析和识别，最大限度规避了人工判断带来的风险，具有很高的可靠性。3.本技术发明用于检测黄曲霉毒素检测过程简单，操作简便，无专业技术人员稍加培训即可完成检测工作，劳动强度大大降低，检测效率大大提高。而传统的生化检测方法，动用仪器和试剂多，检测人员技术水平要求高，检测程序复杂，非专业检测人员不能掌握，本技术发明很好地克服了以上缺点。
图1为黄曲霉毒素BI浓度分别为lppm,3ppm和5ppm时的太赫兹时域谱(溶剂为乙腈)；图2为黄曲霉毒素BI浓度分别为10ppm,30ppm和50ppm时的太赫兹时域谱(溶齐IJ为乙腈);图3为各种浓度下的黄曲霉毒素BI的太赫兹频域谱(溶剂为乙腈);
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。本发明黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法的具体实施方案如下:1.均质样品将固体样品(如花生、大豆、小麦等)去除杂质，用水浸泡，待样品松软后，取出样品放入搅拌器中搅拌1-2分钟，使之高速均质。对于粉状样品，可加水置于锥形瓶中，在摇床上震动30分钟进行均质。2.粗滤与稀释将均质液通过槽纹滤纸过滤，准确移取15ml滤液并加入30ml水进行稀释。3.样品过柱将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取15ml样品提取液注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液约以6ml/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2-3ml空气通过柱体。4.清洗杂质以IOml水清洗亲和柱2次，弃去全部流出的液体，并使2_3ml的空气通过柱体。5.洗脱准确加入1.0ml色谱级甲醇洗脱，流速为l_2ml/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，至此，黄曲霉毒素已被提取出来并保存在甲醇溶剂中。原理黄曲霉毒素免疫亲和柱含有黄曲霉毒素特异抗体，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上，此抗体对黄曲霉毒素具有专一性，而对其他物质没有专一性。注意事项(1)样品过柱、甲醇洗脱速度要慢、均匀(2)洗脱时的溶剂应是可溶解黄曲霉毒素的非极性有机溶剂，本技术发明中使用甲醇作为洗脱剂(3)亲和柱不要在无水状态下时间过长，以免琼脂干燥萎缩(4)用过的免疫亲和柱可反复多次使用。保存方法是，先用4X10ml甲醇+水(70+30，V/V)过柱，调节流速约2滴/秒，再用2X IOml水过柱，流速也为2滴/秒。洗后用Pbs缓冲溶液填充柱子，放入2-8°C冰箱内保存。6.待测样品制备与保存将试管中收集的样品溶液保存在不透光的密闭的玻璃瓶内，放入2_8°C冰箱保存。注意要保持玻璃瓶密闭良好，以免溶剂的挥发。7.制作太赫兹痕量检测样品由于溶剂中保存的黄曲霉毒素一般浓度较低，直接注入比色皿中进行太赫兹波的透射检测，会造成太赫兹响应不敏感甚至无响应的问题，因此本技术发明提出了采用痕量检测的方法，可以有效解决因黄曲霉毒素浓度过低造成太赫兹响应不敏感的问题。具体过程如下:(5)用注射器扎透保存有样品的玻璃瓶上的橡皮塞，提取部分溶液到注射器中(6)将注射器中的溶液滴在载玻片上，用另一载玻片将溶液摊平(7)放在通风处使溶剂挥发，此时载玻片上只留下黄曲霉毒素的薄层(8)重复上述过程，直至载玻片上留有的黄曲霉毒素的薄层有足够的厚度注意事项(I)在载玻片上摊平溶液时应小心、缓慢，尽量均匀不要溢出载玻片外(2)操作过程要做好防护工作，带口罩、手套、穿工作服，以免有毒溶剂对皮肤和呼吸道造成伤害。8.样品的太赫兹时域光谱检测将载玻片放入太赫兹时域光谱检测系统(THz-TDS)样品检测位置，使太赫兹光源焦点对准载玻片的中心，连续照射3分钟，总共进行3次共9分钟检测，以保证取尽可能多的平均值，检测系统将自动采集检测数据并上传给计算机进行处理显示，获取检测样品的太赫兹波谱及其他相关光学参数。在这一步中，得到的太赫兹波谱图如图1-3 (太赫兹检测系统参数如下:飞秒激光脉冲中心波长:800nm ;输出功率:720mW ;太赫兹频率范围:0.2_3T(1T = IO12Hz);光电导材料:砷化镓；太赫兹探测材料:碲化锌；相对湿度小于2%,温度为294K(21°C )。图2和图3检测参数同)所示。图中是按照上述样品制备步骤，分别制备了 lppm, 3ppm, 5ppm, IOppm,30ppm，50ppm的黄曲霉毒素样品，显示了其中部分样品的太赫兹波谱图。9.黄曲霉毒素太赫兹谱库的建立为了能够识别检测的对象，需要事先建立黄曲霉毒素的谱库，以便以后的波谱比对。将已知类型的黄曲霉毒素按照上述方法进行太赫兹波谱检测，得到相应的太赫兹波谱，
建立太赫兹波谱与黄曲霉毒素种类的对应关系，并建立黄曲霉毒素的太赫兹波谱库。10.基于太赫兹波谱检测的黄曲霉毒素类型识别将第8步得到的样品的太赫兹波谱与黄曲霉毒素波谱库中波谱比对，采用模板匹
配法得到相关性最强的黄曲霉毒素的类型，该类型即为样品中黄曲霉毒素的类型。11.向用户出具检测报告。检测报告给出各种类型黄曲霉毒素与样品相关性大小
列表，以及检测人员推荐的样品的黄曲霉毒素类型。表I部分黄曲霉毒素ELISA法与太赫兹法检测结果对照表
权利要求
1.一种黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤: Al，均质样品； A2，粗滤与稀释； A3，样品过柱；将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取15ml样品提取液注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液约以6ml/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2-3ml空气通过柱体； A4，清洗杂质； A5，洗脱；准确加入1.0ml色谱级甲醇洗脱，流速为l_2ml/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，至此，黄曲霉毒素已被提取出来并保存在甲醇溶剂中； A6,待测样品制备与保存 将试管中收集的样品溶液保存在不透光的密闭的玻璃瓶内，放入2-8 V冰箱保存。注意要保持玻璃瓶密闭良好，以免溶剂的挥发； A7，制作太赫兹痕量检测样品，具体过程如下: (1)用注射器扎透保存有样品的玻璃瓶上的橡皮塞，提取部分溶液到注射器中； (2)将注射器中的溶液滴在载玻片上，用另一载玻片将溶液摊平； (3)放在通风处使溶剂挥发，此时载玻片上只留下黄曲霉毒素的薄层； (4)重复上述过程，直至载玻片上留有的黄曲霉毒素的薄层有足够的厚度； AS，样品的太赫兹时域光谱检测: 将载玻片放入太赫兹时域光谱检测系统样品检测位置，使太赫兹光源焦点对准载玻片的中心，检测系统将自动采集检测数据并上传给计算机进行处理显示，获取检测样品的太赫兹波谱及其他相关光学参数； A9,黄曲霉毒素太赫兹谱库的建立 将已知类型的黄曲霉毒素按照上述方法进行太赫兹波谱检测，得到相应的太赫兹波谱，建立太赫兹波谱与黄曲霉毒素种类的对应关系，并建立黄曲霉毒素的太赫兹波谱库；A10，基于太赫兹波谱检测的黄曲霉毒素类型识别 将AS得到的样品的太赫兹波谱与黄曲霉毒素波谱库中波谱比对，采用模板匹配法得到相关性最强的黄曲霉毒素的类型，该类型即为样品中黄曲霉毒素的类型。
全文摘要
本发明公开了一种黄曲霉毒素的太赫兹波谱检测方法，包括以下步骤A1，均质样品；A2，粗滤与稀释；A3，样品过柱；A4，清洗杂质；A5，洗脱A6，待测样品制备与保存；A7，制作太赫兹痕量检测样品；A8，样品的太赫兹时域光谱检测；A9，黄曲霉毒素太赫兹谱库的建立；A10，基于太赫兹波谱检测的黄曲霉毒素类型识别将A8得到的样品的太赫兹波谱与黄曲霉毒素波谱库中波谱比对，采用模板匹配法得到相关性最强的黄曲霉毒素的类型，该类型即为样品中黄曲霉毒素的类型。利用本技术发明对黄曲霉毒素进行检测，突出的优势是检测速度快，具有比一般生化的检测方法更高的智能性；检测过程简单，操作简便。
文档编号G01N21/25GK103163086SQ20131010808
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者徐朝辉, 廉飞宇, 付麦霞, 翟焕趁, 张元 , 白浩 申请人:河南工业大学