专利名称：一种l-半胱氨酸的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基酸的检测方法，尤其是涉及一种L-半胱氨酸的检测方法。
背景技术：
L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一具有还原性基团巯基(-SH)的氨基酸，它在生物体内参与细胞的还原过程及蛋白质、谷胱甘妝的合成(Yang P., Chen Y.H., Zhou Q.Y., et al.Sensitive chemiluminescencemethod for the determination of glutathione, L-cysteine and6_mercaptopurine[J].Microchim Acta, 2008, 163:263-269)。-SH 可与 Ag+、Hg+、Cu2+等金属离子形成不溶性的硫醇盐，与有毒的芳香族化合物缩合成硫醚氨酸而发挥解毒作用，且-SH可以和胱氨酸含有的二硫键(一 S — S —)互相转换，半胱氨酸很容易被氧化形成二硫键，通常将形成二硫键的两个半胱氨酸的状态称为氧化态，而没有形成二硫键的半胱氨酸称为还原态，因此L-半胱氨酸具有较强的还原性。由于L-半胱氨酸的等电点接近中性pH，所以巯基基团通常状况下是存在的并且具有较高的活性，也因此具有很多生物功能(Bulaj G., KortemmeT., Goldenberg D.P..1onization-reactivity Relationships for Csteine Thiols inPolypeptides.Biochemistry, 1998, 37 (25):8965-8972),如增强肝功能、化痰、促进毛发的生长和防止食品氧化等，目前被广泛应用于医药、食品、化妆品及饲料工业。因此，对L-半胱氨酸的研究包括定量分析引起了人们广泛的兴趣并且显得尤为重要。早期，经典法测定氨基酸含量方法有比色法、滴定法、层析法(马家骤等译.食品中添加剂的分析方法[M].日本厚生省环境卫生局食品化学课编.北京:中国标准出版社出版，1988，436)，但是这些方法样品的提取及溶解较复杂，操作繁琐，再则溶液中含有强酸性杂质时测定结果有影响。张卫国利用旋光度与溶液浓度成正比这一性质，采用旋光度法测得样品的L-半胱氨酸含量(张卫国，翟丽.旋光度法测定L-半胱氨酸含量[J].华北煤炭医学院学报，2001，3(4):435)，但是用旋光法测定L-半胱氨酸时必须精制后测量，否则所测旋光度为氨基酸的混合值。在近中性介质及聚乙烯醇(PVA)存在下，半胱氨酸能熄灭一个新的荧光试剂5-(4-氯苯基)-8-苯磺酰氨基喹啉(CPBSQ)与Cu (II )络合体系的荧光的反应。基于此现象，曹秋娥建立了一个测定半胱氨酸的流动注射荧光熄灭方法(曹秋娥，李菲.药物中半胱氨酸的流动注射荧光测定方法研究[J].云南大学学报，2003，25 (3):266-268)，该法简单快速，但对实验条件的控制要求较高。赵成等人利用单扫描极谱法测定胱氨酸与半胱氨酸的含量(赵成，崔吉茂，陈松.单扫描极谱法测定胱氨酸与半胱氨酸的研究[J].职业健康与疾病，2004，19 (3):206)，在
0.0lmoir1Cu20.5mol T1NH4CU0.Smoir1NaOH体系中，胱氨酸和半胱氨酸在750mV处出现灵敏而清晰的波峰，其峰高与胱氨酸和半胱氨酸的含量成正比。该法虽简便快速，但无法区分半胱氨酸和胱氨酸的含量且对仪器要求较高。台湾郑淑华等人利用导电聚合物及金纳米复合材料，发明了一种半胱氨酸含量测定的电化学方法(Hsiao Y., Su ff., Cheng J., et al.Electrochemical determinationof cysteine based on conducting polymers gold nanopar—ticles hybridnanocomposites [J].Electrochimica Acta, 2011，56 (20): 6887-6895)，王力等人也利用了电化学方法检测酸奶中L-半胱氨酸含量(王芳，郑萍，王力，钱勇强.酸奶中L-半胱氨酸的电化学检测[J].中国食品学报，2012，12 (9):204-208)，电化学方法灵敏度高、检测限低，但是需制备电极，对仪器要求高。蔡卫民等人利用高效液相色谱一质谱法测得了老鼠血浆中的炔丙基半胱氨酸含量(Zheng Y., Liu H., Ma G., et al.Determination of S-propar-gyl-cysteinein rat plasma by mixed-mode reversed-phase and cation-exchange HPLC-MS/MS method and its application to pharmacokinetic studies[J].J Pharma BiomedAnal，2011，54(5):1187-1191),王洋等人利用高效液相色谱建立了测定蛋白质粉中L-半胱氨酸含量的方法(王洋，李兆辉，朱海超，朱玉琢.HPLC法测定蛋白质粉中L-半胱氨酸的含量[J].中国药房，2012，23 (29):2753-2754)，结果表明液相色谱法准确度高、快捷，但设备价格昂贵。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的L-半胱氨酸含量测定中存在的上述问题，提供操作简便、专属性高、结果准确可靠，可用于L-半胱氨酸的含量测定的一种L-半胱氨酸的检测方法。本发明包括以下步骤:I)在L-半胱氨酸溶液中加入硼砂溶液，再加入四氯苯醌(TCBQ)溶液，于水浴中反应，然后冷却至室温；2)利用分光光度计检测420nm处吸光值。在步骤I)中，所述L-半胱氨酸溶液、硼砂溶液和四氯苯醌(TCBQ)溶液的体积比可为1: 4:1 ;所述L-半胱氨酸的浓度可为50 300 μ g mL—1 ;所述硼砂溶液的浓度可为
0.0Smoir1jpH为9.6 ;所述四氯苯醌溶液的浓度可为2.5 X IO^mol Γ1 ;所述水浴的温度可为60°C，反应的时间可为60min。在步骤2)中，利用分光光度计检测时，最好以空白样的反应液为参比。本发明具有操作简便、专属性高、结果准确可靠等优点，可用于L-半胱氨酸的含量测定。
图1为本发明实施例反应物与L-半胱氨酸 TCBQ络合物的光谱扫描。在图1中，横坐标为检测波长/nm，纵坐标为吸光度。1、硼砂一氢氧化钠；2、四氯苯醌(TCBQ) ;3、L-半胱氨酸；4、L-半胱氨酸一TCBQ络合物。图2为本发明实施例20种氨基酸 TCBQ络合物反应结果颜色图。在图2中，1、空白(紫色)；2、L-半胱氨酸一TCBQ络合物(黄色)；3、脯氨酸一TCBQ络合物(浅紫色)；4、其他18种氨基酸一TCBQ络合物(紫色)。图3为本发明实 施例20种氨基酸 TCBQ络合物的光谱扫描。在图3中，横坐标为波长/nm，纵坐标为吸光度，1、其他18种氨基酸一TCBQ络合物；2、脯氨酸一TCBQ络合物；3、L-半胱氨酸一TCBQ络合物。图4为本发明实施例L-半胱氨酸 TCBQ络合物420nm处的线性相关性。在图4中，横坐标为L-半胱氨酸浓度/μ g mL—1，纵坐标为吸光度，其回归方程为A=0.035XC+6.22X 10Λ C 为 L-半胱氨酸的浓度，R2=0.9945。图5为本发明实施例L-半胱氨酸 TCBQ络合物425nm处的线性相关性。在图5中，横坐标为L-半胱氨酸浓度/μ g mL—1，纵坐标为吸光度，其回归方程为A=0.035XC+5.49X 10Λ C 为 L-半胱氨酸的浓度，R2=0.9930。图6为本发明实施例L-半胱氨酸 TCBQ络合物检测稳定性检测。在图6中，横坐标为检测波长/nm，纵坐标为吸光度，UL-半胱氨酸一TCBQ络合物O 60min，2、L_半胱氨酸一TCBQ络合物70min。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，以便为更好地理解本发明提供依据。实施例1专属性实验分别配制质量浓度为Ig Γ1的L-半胱氨酸溶液，取ImL于IOmL容量瓶中，加入硼砂溶液4mL，加入TCBQ溶液lmL，用水稀释至刻度，摇匀；将容量瓶置于水浴中反应，反应结束后冷却至室温；利用外分光光度计对L-半胱氨酸 TCBQ络合物、TCBQ、硼砂缓冲液、L-半胱氨酸溶液550 190nm范围内的吸光值进行光谱扫描，结果如图1所求。从图1中看出，L-半胱氨酸 TCBQ络合物的吸收值在350 450nm之间，TCBQ、硼砂缓冲液、L-半胱氨酸溶液在此范围内均无吸收峰。这样既能保证该络合物的灵敏度高，又能排除TCBQJI砂缓冲液、L-半胱氨酸对其测定的干扰，使该法的专属性较高。分别配制20种氨基酸，浓度为Ig L—1，分别取ImL于IOmL容量瓶中，加入硼砂溶液4.0mL, iJPA TCBQ溶液lmL，用水稀释至刻度，摇匀；将容量瓶置于水浴中反应，反应结束后冷却至室温，结果如图2所示。从图2看出，L-半胱氨酸与TCBQ的络合物为黄色，而其他氨基酸与TCBQ的络合物均不显黄色，这样可以排除其他19种氨基酸对其测定的干扰，使用该方法具有专属性较高。实施例2检测范围的选择分别配制20种氨基酸，浓度为Ig L—1，分别取ImL于IOmL容量瓶中，加入硼砂溶液
4.0mL，加入TCBQ溶液lmL，用水稀释至刻度，摇匀；将容量瓶置于水浴中反应，反应结束后冷却至室温，利用光光度计对这20种氨基酸550 330nm范围内的吸光值进行光谱扫描，结果如图3所示。从图3看出，半胱氨酸与TCBQ的络合物的吸收峰在360 440nm之间，脯氨酸络合物的吸收峰在375nm处，其于的18种氨基酸的吸收峰360nm左右，因此当检测波长在420 440nm之间时，L-半胱氨酸的检测值不受其他氨基酸的影响。实施例3检测波长的选择配制50 300 μ g mL_1的L-半胱氨酸溶液，分别取ImL于IOmL容量瓶中，加入硼砂溶液4.0mL，加入TCBQ溶液lmL，用水稀释至刻度，摇匀；将容量瓶置于水浴中反应，反应结束后冷却至室温，利用光光度计对420nm和425nm的吸光值进行检测，并分别绘制工作曲线，结果如图4和5所示。从图5看出L-半胱氨酸浓度为50 300 μ g mL—1内与420nm处吸光度A有良好的线性关系。其回归方程为A=0.035XC+6.22X 10_4，C为L-半胱氨酸的浓度，R2=0.9945。实施例4稳定性检测配制200 μ g mL—1的L-半胱氨酸溶液，取ImL于IOmL容量瓶中，加入硼砂溶液
4.0mL，加入TCBQ溶液lmL，用水稀释至刻度，摇匀；将容量瓶置于水浴中反应，反应结束后冷却至室温，利用分光光度计每IOmin对其检测550 330nm范围内的吸光值进行光谱扫描，结果如图6所示。从图6中看出，当对反应结束后的60min内的检测结果都没有变化，70min才有开始有变化，表明该检测方法在反应结束后60min以内检测都有较高的稳定性。
权利要求
1.一种L-半胱氨酸的检测方法，其特征在于包括以下步骤: 1)在L-半胱氨酸溶液中加入硼砂溶液，再加入四氯苯醌溶液，于水浴中反应，然后冷却至室温； 2)利用分光光度计检测420nm处吸光值。
2.如权利要求1所述一种L-半胱氨酸的检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述L-半胱氨酸溶液、硼砂溶液和四氯苯醌溶液的体积比为1: 4:1。
3.如权利要求1所述一种L-半胱氨酸的检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述L-半胱氨酸的浓度为50 300 μ g mL'
4.如权利要求1所述一种L-半胱氨酸的检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述硼砂溶液的浓度为0.05mol ΙΛ pH为9.6。
5.如权利要求1所述一种L-半胱氨酸的检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述四氯苯醌溶液的浓度为2.5 X 10^3mol L'
6.如权利要求1所述一种L-半胱氨酸的检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述水浴的温度为60°C，反应的时间为60min。
7.如权利要求1所述一种L-半胱氨酸的检测方法，其特征在于在步骤2)中，利用分光光度计检测时，以空白样的反应 液为参比。
全文摘要
一种L-半胱氨酸的检测方法，涉及一种氨基酸的检测方法。提供操作简便、专属性高、结果准确可靠，可用于L-半胱氨酸的含量测定的一种L-半胱氨酸的检测方法。在L-半胱氨酸溶液中加入硼砂溶液，再加入四氯苯醌溶液，于水浴中反应，然后冷却至室温；利用分光光度计检测420nm处吸光值。
文档编号G01N21/31GK103163121SQ20131011235
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月2日 优先权日2013年4月2日
发明者何宁, 严珊, 陈震, 彭雅娟 申请人:厦门大学