专利名称：一种检测食品中大肠杆菌的酶联免疫方法
技术领域：
本发明涉及了一种定量检测食品中大肠杆菌E.coli的双抗体夹心法，属于免疫分析领域。
背景技术：
大肠杆菌(Escherichiacoli, Ε.coli), 1885 年由 Escherich 发现,分布在自然界，主要附生在人或动物的肠道里，为正常菌群，少数的大肠杆菌具有毒性，可引起疾病。E.coli常随粪便散布在环境中，作为温血动物肠道细菌的代表，大肠杆菌常作为饮水和食物(或药物)的卫生学标准。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。目前，检测E.coli的方法有培养法、酶底物法、PCR方法等。培养法是检测E.coli的国标方法，尽管权威可靠，但一般需要10天得到结果，且操作过程繁琐，不能适应快速检测的要求。酶底物法多利用E.coli属特异性的大肠杆菌E.coli或者β-D-葡萄糖苷酸酶的酶学活性催化底物产生荧光，从而在24h内实现对E.coli的检测；其优点是检测时间短，操作简单，缺点是酶活性质易受温度、pH、离子强度的影响，国外产品质量较为稳定，但相对比较昂贵。PCR方法，检测E.coli属特异性的DNA片段，具有灵敏度高、检测时间短的特点，缺点是成本较高、需要较高的操作技术，且不能避免增菌过程。尽管食源性致病菌检测方法在不断发展，酶联免疫方法ELISA凭借其快速、灵敏、特异性好、高通量、不需要大型仪器，易于推广的特点成为目前检测微生物的常用方法。直接检测微生物的ELISA试剂盒检测抗原通常为菌体的表面抗原，检测抗体一般有多克隆抗体和单克隆抗体两种。由于单克隆抗体具有理化性质单一、特异性好、亲和力高并可以无限生产的特点，比多克隆抗体具有更大的应用价值。本发明首次通过制备单克隆抗体并建立起检测大肠杆菌E.coli的双抗体夹心法来实现对大肠杆菌的检测，为食品中大肠杆菌E.coli的快速检测提供了新方法。
发明内容
(一 )要解决的技术问题本发明的目的在于建立一种具有灵敏度高、特异性好、操作方法简单的基于单克隆抗体的大肠杆菌E.coli双抗体夹心法，用于食品中大肠杆菌E.coli的批量、快速检测。( 二 )技术方案为实现上述目的，本发明建立了一种大肠杆菌E.coli的双抗体夹心检测方法，该方法包括对检测方法的优化。其中，单克隆抗体是采用加热灭活的大肠杆菌E.coli 0142 (CMCC44737)菌体经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。其中，用于配对的抗体是通过优化参数下夹心法配对，并通过多次试验筛选确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。一种检测食品中大肠杆菌E.coli的酶联免疫方法，
( I)大肠杆菌Ε.coli单克隆抗体的制备以加热灭活的大肠杆菌E.coli为免疫原，进行免疫、融合、筛选，共筛选到5个细胞株；所述大肠杆菌E.coli为E.coli 0142，保藏号为CMCC44737，购自中国医学微生物菌种保藏管理中心:http: //www.atcc.0rg/Products/All/8739.aspx ATCC 网站链接。(2)单克隆抗体的配对筛选将纯化后的5株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下:包被抗体5 μ g/mL ;包被液为pH9.6、0.0lM的碳酸盐缓冲液；标品浓度100ng/mL，标品稀释液pH7.2、0.0lM的PBS ;酶标抗体稀释500倍使用，在此条件下，实验成功得到了 5对P/N值>2.1的配对；(3)夹心法的建立选择检测限最稳定的配对，即以CGMCC N0.7202抗体为包被抗体，以CGMCCN0.7203抗体作为酶标抗体建 立夹心法；具体参数如下:抗体包被浓度:5 μ g/mL,包被液:ρΗ9.6、0.0lM碳酸盐缓冲液，标品稀释液:pH7.2,0.0lM 的 PBS，检测抗体浓度:4 μ g/mL,反应时间:包被、封闭:37°C，2h ;标准品:37°C，lh ;检测抗体:37°C，lh ;显色12min ;优化后大肠杆菌 E.coli 夹心法，L0D=4.8X 105cfu/mL (检测限 3.3X 106cfu/mL)。其中，建立的夹心法优化了包被抗体的浓度，包被液，封闭液，标准品稀释液，酶标抗体稀释液，酶标抗体稀释浓度。本发明方法的检测分析原理是:酶标板上包被了捕获抗体I (CGMCC N0.7202)，合适的浓度下可以最大限度捕获大肠杆菌E.coli ;洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液220 μ L封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品和对照，37°C孵育Ih ;洗板3次，加入酶标抗体2-HRP(CGMCC N0.7203-HRP)，37°C孵育Ih ;洗板4次，加入显色液显色12min。如果样品中有彡3.3X 106cfu/mL的大肠杆菌E.coli,那么大肠杆菌E.coli被捕获抗体I捕获并与酶标抗体2-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性；如样品大肠杆菌E.coli浓度< 3.3X106cfu/mL那么样品E.coli不被捕获或捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。(三)有益效果本发明提供的大肠杆菌E.coli双抗体夹心检测方法采用了理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，稳定性好、成本低，样品的前处理过程简单，能同时检测大量样品，适合食品行业中大肠杆菌的快速高通量检测。生物材料样品保藏:1、单克隆细胞株2号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC N0.7202，保藏日期2013年I月23日。2、单克隆细胞株3号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC N0.7203，保藏日期2013年I月23日。
图1大肠杆菌E.coli双抗体夹心法的标准曲线。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明。实施例1一、仪器:TGL-40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂KFLOW纯水机，凯佛隆公司ZD-9556水平摇床,太仓科教器材厂96孔8X 12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司MuLtiska Mks 酶标仪，Thermo Labsystems 公司可调试移液器，Thermo Labsystems公司涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂二、试剂:四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司其他试剂均为分析纯试剂三、步骤1.单克隆抗体的制备(I)实验动物:选5只8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。(2)抗原配置:将大肠杆菌培养液加热灭活后离心，去除上清后将沉淀冻存在-20°C直至使用。(3)乳化:将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠。免疫方法:按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合。(4)采血:第三次免疫后I周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。(5)融合、筛选:采用杂交瘤技术进行融合，采用间接Elisa筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆。(6)抗体的纯化和保存:采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20°C保存。2、ELISA 反应过程:抗体效价测定步骤:(I)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 μ L/孔，于4°C冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200μ L PBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。(2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200 μ L/孔，于37°C温育箱内温育2h后取出烘干待用。(3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100 μ L/孔，37°C孵育Ih后洗涤、拍干。(4)每孔加入100 μ L、1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih后洗涤、拍干。(5)每孔加入100 μ L显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37°C反应15min，取出后每孔加入100 μ L终止液(2mol/L的硫酸)，用酶标仅测定吸光值A45。。大肠杆菌E.coli双抗体夹心法测定步骤:a、包被:用5 μ g/mL的I号抗体包被酶标板，100 μ L/孔，4°C过夜。b、洗涤:用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200 μ L/孔，然后甩干反应板。c、封闭:含 0.2% 明胶的 CBS，200 μ L/ 孔，37 °C 封闭 2h。d、洗涤:同 be、样品:用PBS将大肠杆菌E.coli从108cfu/mL开始3倍稀释，一共7个梯度，另设一个PBS空白对照。每孔加入100 μ L样品，于37°C温育lh。f、洗涤:同 bg、加酶标抗体(抗体 2-HRP，4 μ g/mL)，100 μ L/ 孔，37C 反应 lh。h、洗涤:同 b1、显色:加底物 TMBlOO μ L/孔，显色 15min。j、终止:加终止液50 μ L/孔。k、测定:用酶标仪检测OD45tol试验结果如下:1、标准曲线:本发明所获得的检测限为3.3X106cfu/mL，R2=0.99，具体请见说明书附图。2、LOD =LOD是空白的平均吸收值加3倍的标准偏差对应的抗原浓度，大肠杆菌E.coli 双抗体夹心法 L0D=4.8X 105cfu/mL。
权利要求
1.一种检测食品中大肠杆菌E.coli的酶联免疫方法，其特征在于 (O大肠杆菌E.coli单克隆抗体的制备 以加热灭活的大肠杆菌E.coli为免疫原,进行免疫、融合、筛选,共筛选到5个细胞株; 所述大肠杆菌E.coli为E.coli 0142，保藏号为CMCC44737，购自中国医学微生物菌种保藏管理中心； (2)单克隆抗体的配对筛选 将纯化后的5株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下:包被抗体5 μ g/mL ;包被液为pH9.6,0.0lM的碳酸盐缓冲液；标品浓度100ng/mL，标品稀释液pH7.2,0.0lM的PBS ;酶标抗体稀释500倍使用，在此条件下，实验成功得到了 5对P/N值>2.1的配对； (3)夹心法的建立 选择检测限最稳定的配对，即以CGMCC N0.7202抗体为包被抗体，以CGMCC N0.7203抗体为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下: 抗体包被浓度:5 μ g/mL, 包被液:pH9.6,0.0lM碳酸盐缓冲液， 标品稀释液:pH7.2、0.0lM的PBS, 检测抗体浓度:4 μ g/mL, 反应时间:包被、封闭:37°C 2h ;标准品:37°C Ih ;检测抗体:37°C Ih ;显色12min ;优化后大肠杆菌 E.coli 夹心法，L0D=4.8X105cfu/mL。
全文摘要
一种检测食品中大肠杆菌的酶联免疫方法，属于免疫分析领域。本发明应用大肠杆菌E.coliO146(ATCC8739)，购自中国医学微生物菌种保藏管理中心，菌体免疫8周龄的BALB/c小鼠，经过正常的免疫、细胞融合、筛选后得到5株大肠杆菌E.coli单克隆抗体。5株单抗分别标记辣根过氧化物酶(HRP)并进行两两配对。分别以1号单抗CGMCC No.7202为包被抗体、2号单抗CGMCC No.7203为酶标抗体，以大肠杆菌E.coli为标准品建立了大肠杆菌E.coli的夹心ELISA分析方法，LOD为4.8×105cfu/mL，R2=0.99。本发明采用大肠杆菌E.coli作为免疫原，制备了理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的大肠杆菌E.coli单克隆抗体，建立的夹心法为食品中E.coli菌的检测提供了快速、高效的分析手段。
文档编号G01N33/569GK103197073SQ201310122478
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者胥传来, 王文彬, 匡华, 宋珊珊, 刘丽强, 徐丽广, 胡拥明 申请人:江南大学