专利名称：人干细胞自我更新支持因子在肝癌靶向治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明提供人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)在肝癌靶向治疗中的应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其中原发性肝癌占七成以上。我国每年约有11万人死于肝癌，占全世界每年肝癌死亡人数的45%，是高居我国第2位的癌症杀手。肝癌发病常隐匿，早期缺乏典型症状，患者被发现时大多已进入肝癌中、晚期，绝大多数在随后数月内死亡，被称为“急性癌”、“癌中之王”。针对肝癌患者的外科治疗存在手术风险、术后恢复不甚理想的问题，肝移植手术更存在供肝来源和经费等多重问题，难以推广。放疗、局部治疗还有许多关键的临床问题亟待解决，癌基因的耐药性使化疗收效甚微。近年来，肝癌的治疗逐渐聚焦于生物疗法，通过鉴定特异的肿瘤干细胞(CSC)标志分子的表达水平做到早发现早诊断，以及开发出靶向肿瘤细胞的抗癌药物，成为研究者关注的焦点。十多年来科研人员对肿瘤与干细胞关系的研究，多认为肿瘤中存在一小群具有自我更新和分化潜能的细胞即肿瘤干细胞(CSC)可能是肿瘤转移和复发的根源。这群CSC是由干细胞恶变形成的，决定着肿瘤的发生发展。目前已成功在多种实体肿瘤中鉴定分离到CSC,发现了一些CSC表面标记分子如⑶133、EpCAM、⑶90等，而针对CSC特异通路靶点的单克隆抗体则是治疗肿瘤的有效途径。然而限制肝癌干细胞研究的主要问题在于表面分子标记特异性不高，单一靶点治疗有限，能调节不同信号通路的多靶点药物成为研究焦点。人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)最初便是从神经干细胞中分离得到的，在小鼠、蛙等其他生物物种中亦存在同源序列。通过对hSDNSF在人胚胎干细胞中多条信号通路调节作用的研究，以及与成纤维细胞生长因子2 (FGF2)在相同剂量下对干细胞自我更新支持效果的对比，加上初步对其在肝癌患者正常组织、肿瘤组织、癌旁组织中表达量的差异鉴定，推测hSDNSF极有可能是一个癌基因，有理由相信hSDNSF是个潜在的可用于肝癌诊断的标记分子，其单克隆抗体或者抑制剂亦有希望成为新型高效的抗癌药物。
发明内容
本发明的目的在于提供人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)在肝癌靶向治疗中的应用。本发明的人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)在干细胞中调控多条重要信号通路，能替代成纤细胞生长因子2 (FGF2)维持干细胞的自我更新，预示着hSDNSF在肿瘤干细胞中同样重要，能作为肿瘤治疗的靶点分子，其单克隆抗体能成为一种新的高效治疗癌症的药物。本发明通过Western blot手段分析hSDNSF在肝癌患者肿瘤组织、正常组织和癌旁组织中的表达具 有明显差异，hSDNSF在肝癌组织表达明显增加，说明hSDNSF能作为一种新型肝癌分子标记物，用于肝癌的诊断。
本发明的技术方案包括人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)的体外重组表达，流式细胞仪检测hSDNSF对干细胞的自我更新支持作用，hSDNSF对人胚胎干细胞支持作用的机制研究及与FGF2作用机制的对比，人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)在肝癌患者正常组织、肿瘤组织、癌旁组织中表达量的差异鉴定四部分内容。人干细胞自我更新支持因子hSDNSF在2003年以维持神经干细胞干性的身份首次出现在世人的眼中，其前体由146个氨基酸组成，其中1-26位氨基酸(斜体部分)为信号肽部分，该前体全序列一级结构为:
MTM^SLMTPFLCGLLWAFCAPGAIMEEPAASFSQPGSMGLmmYEOQEEmEELEGYI 60 NKPEAEMSPQELQLHYFKMHDYDGNNLLDGLELSTAITHVHKEEGSEQAPLMSEDELINI 120 IDGVLRDDDKNNDGYIDYAEFAKSLQ-146
hSDNSF CDS序列5’端至3’端序列如下，其中第79-438位核苷酸编码成熟的hSDNSF蛋白:
atgaccatgagatccctgctcagaacccccttcctgtgtggcctgctctgggccttttgt 60gccccaggcgccagggctgaggagcctgcagccagcttctcccaacccggcagcatgggc 120ctggataagaacacagtgcacgaccaagagcatatcatggagcatctagaaggtgtcatc 180aacaaaccagaggcggagatgtcgccacaagaattgcagctccattacttcaaaatgcat 240gattatgatggcaataatttgcttgatggcttagaactctccacagccatcactcatgtc 300cataaggaggaagggagtgaacaggcaccactaatgagtgaagatgaactgattaacata 360atagatggtgttttgagagatgatgacaagaacaatgatggatacattgactatgctgaa 420tttgcaaaatcactgcagtag441 本发明的重组表达的人源干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)在单因子10 ng/ml的条件下就能够支持人胚胎干细胞的自我更新，功能与FGF2非常类似,在用western blot的方法分析具体的作用信号通路时，以人胚胎干细胞为研究载体，系统研究了 hSDNSF在MAPK、Akt、TGF-b、Wnt以及转录因子调节网络中的作用，发现hSDNSF能够抑制ERK、JNK、Akt途径的磷酸化，与FGF2作用类似。在TGF-b信号通路中，hSDNSF能够促进Smad2的磷酸化，同时抑制Smadl的磷酸化。在转录因子调控网络中，hSDNSF和FGF2都能够激活干细胞干性关键基因0ct4和Nanog的表达，同时也能够调控Sox2的表达在一个合适的水平从而维持干细胞的不分化。利用western blot方法对9例肝癌患者正常组织、肿瘤组织和癌旁组织hSDNSF表达水平进行检测，发现hSDNSF在其中8例肿瘤组织中高表达，在正常组织和癌旁组织中几乎不表达。研究表明:hSDNSF是一个肝癌分子标志物，能用于肝癌的分子诊断。同时，由于其对维持干细胞自我更新的多条信号通路均具有显著促进作用，因而其单克隆抗体或者抑制剂能作为抗癌药物被开发应用。
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图1A hSDNSF S印hadexG-50 层析结果(3 ml/管/10 min)，洗脱峰监测 215/280 nm 吸收值，箭头标注的峰为目的蛋白峰。图1B hSDNSF RP-HPLC分离纯化结果，在乙腈梯度达到51%左右时，洗下14000 Da左右的蛋白质分子，箭头所指即为目标蛋白峰。图1B中还附有RP-HPLC目标峰SDS-PAGE电泳图，图中Marker旁泳道为箭头目标峰。图2流式细胞仪检测hSDNSF对人胚胎干细胞自我更新支持作用。A图为无FGF2，B 图为添加 10ng/ml FGF2, C 图为添加 10ng/ml rhSDNSF。图3A-E hSDNSF对人胚胎干细胞自我更新Western blot分析，A图为MAPK信号通路，B图为Akt信号通路，C图为TGF-b信号通路，D图为Wnt信号通路，E图为3个重要的核转录因子。阿拉伯数字分别代表三种加样方式:1，No FGF2 ；2,10 ng/ml FGF2 ； 3，10ng/ml hSDNSFο图4 Western blot方法检测hSDNSF在9例肝癌患者正常组织、肿瘤组织、癌旁组织中的表达情况。
具体实施方式
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实施例一:人干细胞自我更新支持因子hSDNSF的体外重组表达 A重组质粒pET-hSDNSF的构建 第一步:hSDNSF基·因的合成
待表达基因加上表达所需的各个位点以后送上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并将合同基因克隆到载体PUC57上，插入位点为KpnI/Hindlll，受体菌为大肠杆菌DH5 α菌株，并在基因的两端分别加入酶切保护碱基和以保证正常酶切和切割效率。合成的序列如下，其中GGTACC为KpnI酶切位点，AAGCTT为HindIII酶切位点，GACCCG为甲酸切割位点:
^tmggtaccgacccggagcctgcagccagcttctcccaacccggcagcatgggcctggataagaacacagtg
CACGACCAAGAGCATATCATGGAGCATCTAGAAGGTGTCATCAACAAACCAGAGGCGGAGATGTCGCCACAAGAATT
GCAGCTCCATTACTTCAAAATGCATGATTATGATGGCAATAATTTGCTTGATGGCTTAGAACTCTCCACAGCCATCA
CTCATGTCCATAAGGAGGAAGGGAGTGAACAGGCACCACTAATGAGTGAAGATGAACTGATTAACATAATAGATGGT
GTTTTGAGAGATGATGACAAGAACAATGATGGATACATTGACTATGCTGAATTTGCAAAATCACTGCAGTAAAAGCT
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第二步:质粒DNA的制备
接种pET32a+质粒的大肠杆菌载体菌株(美国Novagen公司)于5 ml含氨节的LB培养基中，37°C摇床中培养过夜，使用质粒提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取质粒，具体步骤如下:
1)5 ml pET32a+过夜培养物，12000 rpm，离心I分钟，完全弃去上清，菌体收集至一管中。2)柱平衡:吸附柱放入收集管中，加500 μ I平衡液，12000 rpm离心I分钟，弃
去收集管中的液体。3)先菌体中加入250 μ I溶液I (2_8°C保存)，悬浮菌体。加入250 μ I溶液2，颠倒混匀6-8次，此时，管中应是清亮的液体。否则为裂解不充分，应减少菌体量。再向管中加350 μ I溶液3，颠倒混匀6-8次，管中出现白色沉淀，12000 rpm离心10分钟。吸取上清至吸附柱中，勿吸取白色沉淀。4) 12000 rpm离心I分钟，弃去收集管内的液体。5)向吸附柱中加入500μ I去蛋白液，12000 rpm离心I分钟，弃去收集管内的液体。6)力卩600 μ 1漂洗液，12000 rpm离心30秒钟，弃废液。再加入600 μ I漂洗液，12000 rpm离心30秒钟，弃废液。12000 rpm离心2分钟。
7)吸附柱放入一干净离心管中，开盖晾干。8)洗脱液需预先在65_70°C水浴锅中预热。向吸附柱中央加入50 μ I洗脱液。室温下放置2分钟。12000 rpm离心2分钟，收集离心管中的液体，即为所提质粒，_20°C保存。第三步:PET32a+质粒和目的基因的双酶切及连接
37°C同时双酶切(KpnI和HindIII，Fermantas)pET32a+质粒和带上酶切位点和甲酸识别位点的目的基因，双酶切总体系体系为20 μ 1，酶切程序和具体操作参照Fermantas双酶切工作手册。I %琼脂糖核酸凝胶电泳后，切取目的条带，利用凝胶DNA回收试剂盒(北京天根生物科技有限公司)回收双酶切产物，重溶于PCR水，置-20 °C保存备用。将回收到的双酶切产物线性pET32a+质粒和目的基因在T4 DNA Ligase (Takara)作用下连接，16 °C连接过夜。B.重组质粒的转化
将连接产物转化至用CaCl2-MgCl2法制备的大肠杆菌BL21 (DE3 )感受态细胞，取适量转化产物涂布至含100 yg/ml氨苄青霉素(以下简写为Amp)的LB培养基平板上，经37°C培养16小时，用PCR检测，将阳性克隆送生物公司进行测序并确认包含有hSDNSF基因序列，且含有接头和甲酸切割位点序列。C.目的基因的诱导表达
37°C, 100 μ g/ml Amp液体LB培养基(I ml)中培养用AnSF重组质粒12小时以上，当OD6tltl达到0.6时，转入2 L 100 μ g/ml Amp液体LB培养基，37 °C培养3小时，OD600达到0.6，加入IPTG至终浓度0.6 mM,28 °C低转速(120 rpm)诱导2.5小时。诱导产物冰浴30分钟，于4 V 8000 X g离心5分钟，用50 mM pH8.0的Tris-HCl，洗涤沉淀3次，每次洗涤结束都于4 V 8000 X g，离心5分钟，收集沉淀，置-20°C保存备用。取少许诱导沉淀物，用2 X Loading Buffer裂解，沸水煮5分钟，进行12 %SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白是否诱导表达成功。D.分离纯化重组表达的hSDNSF 第一步:含hSDNSF的His-Tag融合蛋白分离
将收集到的诱导沉淀物重悬于Binding Buffer中(50 ml/1 L发酵产物)，超声充分裂解诱导产物(超3 sec，停3 sec，共10 min), 4 V 12000 X g离心20分钟，取上清，经0.45 μ m滤膜过滤，上样于用Binding Buffer平衡好His-Bind Resin (Merck)亲和柱层析(亲和层析的程序具体参照Merck提供的His-Bind Resin说明书)，除去其他杂蛋白后，洗脱收集His-Tag融合蛋白。第二步:甲酸化学切割释放hSDNSF
将上一步收集到的His-Tag融合蛋白按照50%甲酸的比例，50 °C，切割24小时，切割完后低压冻干化学切割产物，置-20°C保存备用。第三步:hS DNSF分离纯化
Sephadex G-50凝胶过滤层析，将冻干粉溶解于pH6.0，0.1M的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(以下简写为PBS)，12000 X g离心10 min，取上清上样于已用溶解冻干粉的pH 6.0 PBS平衡好的Sephadex G-50 ( Pharmacia)凝胶过滤柱(I 000 mm X 26 mm)，用同样缓冲液洗脱，自动部分收集器进行收集，流速为3.0 ml/管/10 min，于280 nm和215 nm紫外检测收集液中蛋白的浓度，洗脱结束后跑12 %的SDS-PAGE电泳，如图1A所示，将含有目的条带大小的分子筛的峰收集起来，冻干备用。反相高压液相层析(RP-HPLC)，将Sephadex G-50凝胶过滤所得到的含有目的条带大小的冻干峰溶于双蒸水中，4 °C, 12 000 X g离心10 min,取上清液,经0.22 μπι滤膜过滤，收集滤液于Waters 600 Controller (Waters,美国)液相色谱仪上分析，采用反相C8柱(Waters C8, 30 X 0.46 cm)，以双蒸水(含0.1 %三氟乙酸):乙腈(含0.1 %三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，280/215 nm紫外检测蛋白浓度，流速0.7 ml/min。收集所得到的各个组分，低压冻干取部分溶解于双蒸水后跑12 %的SDS-PAGE电泳，结果如图1B所示，确认与hSDNSF理论分子量大小基本吻合，为14000Da，对应峰用Matrix-AssistedLaser Desorption 1nization Time-Of-Flight mass spectrometry (MALD1-T0F)再次确定其精确分子量(AXIMA CFR光谱仪，Kratos Analytical)为13502.03Da所以推断该洗脱峰为rhSDNSF。实施例二:流式细胞仪检测hSDNSF对干细胞的支持作用 A.人胚胎干细胞的常规培养:
第一步:饲养层细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)的做法取怀孕13.5天的ICR小鼠胚胎，将胎鼠的头、四肢、尾巴和内脏去掉，剩余组织用5 mg/ml的IV型胶原酶(Gibco)消化为单细胞(37°C;30分钟)，接种于0.1 %明胶(Amresco)包被的培养皿上，培养基为DMEM (Gibco)加10 %胎牛血(Hyclone)，I X非必须氨基酸(non-essential amino acid; Gibco)，2 Mmol/L L-谷氨酉先胺(sigma), 0.1 mM β -疏基乙醇(sigma)和青链霉素(sigma)，培养于37 °C，5 % CO2培养箱(HEPA)中。等原代细胞生长至融合后，按1:3进行传代,传代24小时后进行冻存,冻存液为常规培养基加10 %DMSO (sigma),细胞冻存于液氮中。
第二步:接种胚胎干细胞前饲养层的准备
解冻饲养层细胞，生长至融合状态时用10 Kg/ml丝裂霉素C (sigma)处理3个小时，按4 X IOVcm2接种于明胶包被的培养皿中。第三步:接种胚胎干细胞
人胚胎干细胞接种于准备好的饲养层细胞上，培养基为Knockout DMEM (Gibco)加20%血清替代品(Gibco)，IX非必须氨基酸，2 μΜ L-谷氨酰胺，0.1 mM β -巯基乙醇，10 ng/ml FGF2 (Millipore)和100 U/ml青链霉素,每天更换新鲜培养基。第四步:胚胎干细胞传代
用I mg/ml IV型胶原酶消化后收集集落，反复吹打至较小团块后再接种于新的饲养层细胞上继续培养，或进行相关的分化或更新的实验。B.hSDNSF对人胚胎干细胞自我更新的维持 第一步:设计实验组合
设定三个组合，分别是:没有FGF2、10 ng/ml FGF2U0 ng/ml hSDNSF，在上述培养条件下进行胚胎干细胞培养，每天换液。四天后收集细胞样品进行流式细胞仪分析0ct4 (SantaCruz)阳性率分析。第二步:流式细胞仪分析集落的消化方式与传代时相同，消化获得的集落用干细胞培养基重悬，在明胶包被的培养皿上贴壁半小时以除净多余的饲养层细胞，收集集落进行离心，细胞培养用磷酸缓冲液PBS清洗三次，再用0.05 %胰蛋白酶(Gibco)消化为单细胞，4 %多聚甲醛(sigma)固定10分钟，离心后用5 % PBS洗一遍，0.2 % Triton X-100孵育10分钟以增加抗体对细胞膜的通透性，离心后再洗一遍。分为两份，转入小管，一份作为对照，另一份作为样品。加一抗，0ct4 (Santa Cruz )按1:100稀释于I %牛血清白蛋白(sigma)中，37 °C孵育30分钟；染完一抗后离心，洗一遍。加二抗，鼠IgGl-FITC (1:100稀释；Santa Cruz)，室温孵育I小时，离心洗一遍，用500 ml 5 % N-氯代丁二酰亚胺一磷酸缓冲液(NCS-PBS)重悬细胞，进行流式细胞仪(Becton Dickinson, FACS Vantage SE)分析。流式细胞仪的结果如图2显示:hSDNSF能够取代FGF2单因子维持人胚胎干细胞的自我更新，在10 ng/ml时就可以明显支持胚胎干细胞的自我更新。实施例三:hSDNSF对猴胚胎干细胞支持作用的机制研究及与FGF2作用机制的对t匕
A.人胚胎干细胞细胞培养及蛋白提取和浓度测定
取上述经hSDNSF处理过的胚胎干细胞，用I ml预冷的PBS洗涤细胞2次。每管细胞内加入 400 μ I RIPA 细胞裂解液[50mM Tris-HCl (pH 7.4) , I % Nonidet P-40, 0.25% 脱氧胆酸钠，150 mM NaCl，I mM EDTA, I mM PMSF, I mM NaF, I mM Na3VO4,各 I μ g/ml 的 aprotinin, Ieupeptin 和 pepstatin],冰上裂解 30 min。4 °C, 12 000 g 离心 20min,小心吸取上清,并将上清分装至新的eppendorf管,吸取2 μ I用Bradford法测定蛋白浓度，剩余按一定体积分装后迅速冻于-20 °C。B.Western blot 分析
将等量于40微克蛋白的细胞裂解物与6XSDS样品缓冲液混匀后95-100 °C加热5min，冷却后加入各泳道。恒压电泳:浓缩胶90 V，分离胶120 V。电泳结束后用湿转法转至PVDF膜。转膜结束后用Tris-HCl缓冲盐溶液(以下简写为TBS)洗涤5 min后，用5 ml封闭液(1XTBS，0.1 % Tween-20, 5 %脱脂奶粉)室温封闭I小时后用TBS_Tween20 (以下简写为TBST)洗涤膜三次，每次5 min。然后与预先稀释好的一抗反应，置静音混合器摇动于4 °C过夜。一抗孵育完后，用TBST洗涤三次，每次5 min。然后与用封闭缓冲液预先稀释的二抗反应，轻轻振荡I小时。用TBST洗涤三次，每次5 min。使用天根公司的ECL反应物，暗室中曝光显色。显色结果如图3A-E所示，发现hSDNSF与FGF2在MAPK及Akt信号通路中作用一样，均抑制ERK、JNK、Akt途径的磷酸化。在TGF-b信号通路中，BMP4蛋白表达量基本没有变化，而Smadl的磷酸化水平在FGF2组和hSDNSF组以及混用组都很低，Smad2的磷酸化水平在FGF2组和hSDNSF组中水平升高。而Smad2磷酸化被激活，Smadl磷酸化被抑制是人胚胎干细胞进行自我更新的重要特征。在转录因子调控网络中，hSDNSF和FGF2都可以激活干细胞干性关键基因0ct4和Nanog的表达，Sox2的表达则小于对照组，这可能是三者在维持干细胞不分化的动态平衡关系所导致的。由此可看出hSDNSF与FGF2作用机制存在高度相似性。
实施例四:人干细胞自我更新支持因子hSDNSF在肝癌患者正常组织、肿瘤组织、癌旁组织中表达量的差异鉴定A肝癌患者组织的处理 第一步:组织的存放
肝癌患者的正常组织、肿瘤组织、癌旁组织为云南省肿瘤医院手术实施过程中采得的新鲜组织，置于-80°C冻存。第二步:组织裂解
将组织取出，液氮中冻十秒，迅速包进锡箔纸中裹好，用重器锤击至碎，立即将之倒入适量RIPA (强)裂解液(临用前加入终浓度为ImM的苯甲基磺酰氟PMSF)中(具体量比参照碧云天RIPA裂解液说明书)，冰上放置10分钟以上，4°C，12000 rpm离心10分钟，取上清小量分装数管，置于_20°C存放，剩余-80°C冻存。分析
Western blot步骤同例三中一致。上样前不必测定蛋白浓度,第一次保证上样体积一致，随后根据显影结果中内参水平的高低调整上样量。结果如图4所示，能够非常明显的看至IJ，在9例病患的正常组织和癌旁组织中几乎看不到hSDNSF的表达，而在8例病患的肿瘤组织中能够看到hSDNSF高水平的表达。这说明hSDNSF能够很好的作为肝癌组织的分子标记物。结合前面信号通路的实验结果，hSDNSF为癌基因。同时由于其对多条促进干细胞保持干性的信号通路因子的激活作用，针对hSDNSF的单克隆抗体或者抑制剂能成为一种高效的靶向抑癌药物。 ·
权利要求
1.人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)在干细胞中调控多条重要信号通路，能替代成纤细胞生长因子2 (FGF2)维持干细胞的自我更新，预示着hSDNSF在肿瘤干细胞中同样重要，能作为肿瘤治疗的靶点分子，其单克隆抗体能成为一种新的高效治疗癌症的药物。
2.通过Westernblot手段分析hSDNSF在肝癌患者肿瘤组织、正常组织和癌旁组织中的表达具有明显差异，hSDNSF在肝癌组织表达明显增加，说明hSDNSF能作为一种新型肝癌分子标记物， 用于肝癌的诊断。
全文摘要
本发明提供人干细胞自我更新支持因子(hSDNSF)在肝癌靶向治疗中的应用，属于生物医学技术领域。本发明以人干细胞自我更新支持因子hSDNSF为研究对象，以常规培养胚胎干细胞的添加因子FGF2为参照，对其在人胚胎干细胞中的各信号通路及转录因子调控网络中的作用做了系统的研究工作，发现二者在促进干细胞自我更新机制上的惊人相似。后在肝癌患者正常组织、肿瘤组织和癌旁组织检测到hSDNSF表达水平存在非常明显的差异，标志着hSDNSF是一种很好的肝癌标记分子。由于其多通路多靶点性，针对hSDNSF的单克隆抗体或者抑制剂将会是非常出色的抑癌药物。由此，hSDNSF及其单克隆抗体和抑制剂在肝癌的诊断和靶向治疗中具有巨大的应用价值。
文档编号G01N33/68GK103223166SQ201310124548
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者赖仞, 郝雪, 刘欢 申请人:中国科学院昆明动物研究所