南板蓝根hplc指纹图谱的建立方法
【专利摘要】本发明提供了一种南板蓝根的HPLC指纹图谱质量控制方法，包括供试品溶液的制备，色谱条件的确定，使用高效液相色谱仪进行测定,得到南板蓝根药材及其提取物HPLC指纹图谱，较全面地表达了南板蓝根的整体化学信息，确定其指纹特征，该指纹图谱具有方法简便、重复性好、特征峰多、准确可靠的特点。所建立的HPLC指纹图谱能有效地控制南板蓝根药材的质量。
【专利说明】南板蓝根HPLC指纹图谱的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种南板蓝根药材HPLC (高效液相色谱)指纹图谱的建立方法，以及由此所得的南板蓝根药材的HPLC标准指纹图谱，属于药物质量分析【技术领域】。
【背景技术】
[0002]南板蓝根来源于爵床科植物马蓝βειρ?ιicacanthuscusia (Nees) Bremek.的干燥根及根莖，其与北板蓝根(十字花科植物蒋蓝indigotica Fort.的根)于基源、化学成分组分、临床应用等方面均有差别。南板蓝根为贵州省道地药材之一，具有清热解毒，凉血消肿功效，主治温毒发斑，丹毒，流行性感冒等，为华南地区及东南亚常用的治疗呼吸道疾患的抗病毒良药，多以栽培为主。但随着其市场逐步扩大，药材需求量增加，现人工种植南板蓝根已成为该药材供应源中的重要一环，故种质资源质量控制的技术水平对药材的产量、质量、市场销售等有决定性的影响。
[0003]目前已知的技术中，南板蓝根的现有质量控制手段主要囿于无法全面反映化学成分整体信息。中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。南板蓝根尚未有报道其HPLC指纹图谱技术的依据，通用的指纹图谱质量控制技术可有效弥补此空白。
[0004]因此，针对南板蓝根目前存在的不足，本发明以HPLC梯度洗脱法对南板蓝根药材指纹图谱进行研究，选用采集的不同批次南板蓝根药材完成了其指纹图谱适用性检验，所建立的指纹图谱能较全面地体现南板蓝根药材的整体化学信息；建立的南板蓝根药材HPLC指纹图谱中各化学成分共有峰的分离度及峰形好，且该指纹图谱重复性好，可操作性强，符合检测要求，为南板蓝根药材提供了一种全新的、普遍适用、方便易行的质量控制方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的为南板蓝根药材HPLC指纹图谱提供一种构建方法，以及由此方法所得到的南板蓝根药材指纹图谱。
[0006]本发明的南板蓝根药材HPLC指纹图谱构建方法如下:
1、南板蓝根药材HPLC指纹图谱的构建方法:
1.1供试品溶液的制备:取本品粉末(过80目筛)约0.5g，精密称定，置量瓶中，精密加入25ml水溶液，称定重量，分别进行超声处理、加热回流、正丁醇萃取30分钟，放冷，再称定重量，分别用溶液补足减失的重量，摇匀，离心，精密量取上清液20mL，置蒸发皿中，挥去溶齐U，定容至5ml量瓶中，滤过，即得；
1.2 HPLC 分析:色谱条件为:色谱柱:Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18 柱(250mmX4.6 mm, 5 μ m);柱温:20 V ?35 V (优选柱温:30 V );流速:0.8mL.mirT1 ?1.2mL.mirT1 ;色谱峰光谱采集范围:190 nm?400 nm,流动相为甲醇-0.05%磷酸水,采用线性梯度洗脱方式:0分钟一10分钟一60分钟一65分钟，甲醇:2% — 2% — 50% — 50%, 0.05%磷酸水溶液:98% — 98% — 50% — 50%,检测波长280 nm±2 nm,得到南板蓝根药材HPLC指纹图谱。
[0007]按上述发明的方法，通过对11批南板蓝根药材样品构建HPLC指纹图谱并进行分析比较，找出其共有特征峰(共10个峰)，得到南板蓝根药材的指纹图谱，22个共有峰的保留时间(tK)分别为:2.1分钟3.9分钟、5.8分钟、6.6分钟、33.6分钟、39.3分钟、44.3分钟、47.6分钟、50.1分钟，53.0分钟。
[0008]发明人在下文实施例1的补充的试验中，分别使用Hypersil C18 (4.6mm X250mm,5 μ m)、Diamensil C18 (4.6mm X 250mm,5 μ m)、Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18(4.6mm X 250mm, 5 μ m)三种十八烧基娃烧键合娃胶柱,照上述方法进行试验,结果表明，采用Agilent C18柱进行分离，峰数较多，分离度较好。此外，上述三种柱子在进行重复测定时，以峰面积最大的色谱峰(图2中的5号峰)进行计算，理论板数降低一半(从约5000降至2500)所能循环测定的次数计，Agilent柱达144次,而Hypersil和Diamensil分别75次和83次，显示Agilent柱比其它型号的柱子明显地更稳定。故采用该柱进行本发明HPLC特征图谱分析是有益的。
[0009]发明人在下文实施例1的另一补充试验中，出人意料地发现，在30°C时，相对保留时间的日间差异显著比其它温度下稳定。例如在图2中，在30°C，柱温条件下，以5号峰为基础，计算10号峰的相对保留时间约1.62 ;发明人在随后的10天中每天连续测试3次计算该10号峰的相对保留时间，结果10天结果为1.61 ±0.07，即其RSD为4.3% ;而25°C、35°C、40°C三种条件连续测试10天计算所得RSD分别为16.8%、15.3%、17.7%，显示在这些柱温条件下方法学更稳定。考虑到对于色谱柱的保护和实验检测方法的适用性，故选择柱温为 30。。。
[0010]南板蓝根药材HPLC指纹图谱方法具有以下显著的优点和用途:
a.所建立的指纹图谱能较全面地体现南板蓝根药材的整体化学信息；
b.本方法指纹图谱较已知的其它南板蓝根质量控制方法而言，反映化学成分信息量大，色谱峰个数多，分离度好，质量控制水平更高；
c.与已公开技术相比，本方法的供试品溶液制备过程更加简捷、色谱条件更易于实现，实验结果重现性更好。
[0011]
【专利附图】
【附图说明】
图1 11批不同产地南板蓝根药材指纹图谱叠加图；
图2 11批不同产地南板蓝根药材指纹图谱共有模式。
【具体实施方式】
[0012]实施例1:南板蓝根药材HPLC指纹图谱的建立方法 I仪器、样品、试药及试剂
1.1仪器:Agilent 1100高效液相色谱仪，DAD检测器，Agilent Chemstat1n色谱工作站，色谱柱:Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18 (250 mmX4.6 mm, 5 μ m)；
1.2样品:11批南板蓝根药材样品，分别来自贵州省内不同地区，经鉴定均为爵床科植物马iBaphicacant huscusia (Nees) Bremek 的干燥根莖及根；
1.3试药:腺苷(批号:879-200001)购于中国药品生物制品检验所；1.4试剂:甲醇为色谱纯,水为纯净水,其余试剂均为分析纯；
2方法
2.1供试品溶液的制备:取本品粉末(过80目筛)约0.5g，精密称定，置量瓶中，精密加入25ml水溶液，称定重量，加热回流I小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，离心，精密量取上清液20mL，置蒸发皿中，挥去溶剂，定容至5ml量瓶中，滤过，即得；
2.2 HPLC分析:色谱柱:Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18柱(250 mmX4.6 mm, 5 μ m)；柱温:30°C ;流速:1.0 mL.mirT1 ;色谱峰光谱采集范围:190 nm~400 nm，检测波长250nm。甲醇-0.05%磷酸梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1 ;
表1梯度洗脱条件
【权利要求】
1.一种南板蓝根高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤: 步骤一，供试品溶液的制备:取本品粉末(过80目筛)约0.5g，精密称定，置量瓶中，精密加入25ml水溶液，称定重量，分别进行超声处理、加热回流、正丁醇萃取30分钟，放冷，再称定重量，分别用溶液补足减失的重量，摇匀，离心，精密量取上清液20mL，置蒸发皿中，挥去溶剂，定容至5ml量瓶中，滤过，即得； 步骤二，高效液相色谱分析:精密吸取步骤一的供试品溶液2 μ L^20 μ L进样，色谱条件如下:色谱柱为Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18柱，填料粒径2 μ m?8μηι,柱长150 mm ?250 mm,柱温:20°C ?35°C ;流速:0.8 mL.mirf1 ?1.2 mL.mirf1 ;色谱峰光谱米集范围:190 nm?400 nm，流动相按体积比由甲醇-0.05 %磷酸水溶液混合而成，采用线性梯度洗脱方式:从O分钟一35分钟一40分钟一53分钟一56分钟一80分钟，甲醇:2% — 2% — 50% — 50%, 0.05% 磷酸水溶液 98% — 98% — 50% — 50% (体积比)，检测波长 280nm±2 nm ;得到南板蓝根HPLC指纹图谱； 步骤三，分析比较:测定11批南板蓝根药材样品高效液相色谱指纹图谱并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的南板蓝根药材指纹图谱，该指纹图谱具有的10个共有峰的保留时间tK分别为:2.1分钟3.9分钟、5.8分钟、6.6分钟、33.6分钟、39.3分钟、44.3分钟、47.6分钟、50.1分钟，53.0分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是:保留时间tK= 33.6分钟的第5号峰为腺苷。
【文档编号】G01N30/86GK104133003SQ201310158540
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年5月2日 优先权日:2013年5月2日
【发明者】张丽艳, 杨丹, 黄健, 徐昌艳, 罗君, 谢宇, 卿娟 申请人:贵阳中医学院