快速检测微量磺胺氯哒嗪的试纸条及制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速检测磺胺氯哒嗪的试纸条及其制备方法，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层，在纤维素膜层上设有偶联磺胺氯哒嗪的载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的对照印迹，金标抗体为胶体金标记的磺胺氯哒嗪抗体。本发明的试纸条特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，适用范围广，成本低，操作简便，能满足不同层次人员需要，具有广阔的市场前景，易于推广应用。
【专利说明】快速检测微量磺胺氯哒嗪的试纸条及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽药残留的免疫化学检测领域，特别是涉及一种快速检测微量磺胺氯哒嗪的免疫胶体金试纸条及制备方法。
技术背景
[0002]磺胺氯哒嗪(sulfachloropyridazine，SPDZ)分子式CltlH9ClN4O2S,分子量 2别.72,是一类抑制核酸合成的人工合成抗菌药，属于广谱抗菌药物，具有毒性小、口服易吸收等特点，对许多革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌都有抑菌作用。由于磺胺类药物的价格低廉及其有效的抑菌作用，作为预防与治疗用药被广泛用于畜牧养殖业中。但磺胺氯哒嗪的不合理使用甚至滥用，一方面会引起耐药菌株的出现，导致对动物性食品的污染和人类健康的威胁；另一方面会引起动物性食品中磺胺类药物的残留，破坏机体正常菌群生态平衡、弓丨发过敏性反应和尿及造血紊乱等，且有致肿瘤的潜在危害。因此，磺胺类药物的残留检测备受关注。我国、美国以及欧盟等均将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物，单个磺胺或总磺胺类的最高残留限量为0.lmg/kg。因此，应积极研究其有效、实用、简便的检测方法，打击违规添加等违禁行为，为控制其滥用提供简便快速准确的检测手段，确保饲料和食品安全。
[0003]目前国内外测定磺胺氯哒嗪在饲料和动物性食品中残留的方法种类较多，主要是采用理化分析方法，包括高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)、气相色谱/质谱联用分析法(GC/MS)、生物学检测、毛细管电泳法等。这些方法检测磺胺氯哒嗪灵敏度高，特异性强，但是样品需经一系列复杂的处理净化，繁琐费时，从样品预处理到得出检测结果至少需要2天时间；同时该检测方法需要大型专门仪器设备和专业技术人员操作，无法进行现场检测，时效性差，难以推广。免疫学检测法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度高，分析过程相对简单，用作磺胺氯哒嗪的筛查有独特优势，是需要优先发展的检测技术，但目前磺胺氯哒嗪免疫学检测方法急待研究解决。
[0004]
【发明内容】
:
本发明要解决的技术问题:提供一种特异、灵敏、快速、简便的快速检测微量磺胺氯哒嗪的试纸条；
还提供一种检测微量磺胺氯哒嗪的试纸条的制备方法。
[0005]本发明的技术方案:
一种快速检测微量磺胺氯哒嗪的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层，在纤维素膜层上设有偶联磺胺氯哒嗪的载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的对照印迹,金标抗体为胶体金标记的磺胺氯咕嗪抗体。
[0006]所述偶联磺胺氯哒嗪的载体蛋白溶液是通过以下方法得到的:称取3.5 mg磺胺氯哒嗪钠置于10 mL螺口瓶中，用2mL 0.2mol/L的盐酸溶解；冰浴冷却后，避光边搅拌、边逐滴加入灭菌双蒸水溶解已预冷的I mol/L的NaNO2溶液，NaNO2溶液的用量以用淀粉碘化钾试纸检验呈蓝黑色为宜，4°C反应6h，得重氮化的磺胺氯哒嗪钠；称取IOmg载体蛋白溶于I mL pH 7.2的PBS缓冲液中，预冷后边搅拌边逐滴加入重氮化的磺胺氯哒嗪钠，用I mol/L的NaOH调节pH至8_9，4°C过夜反应；反应产物在4°C搅拌下用PBS透析3天，每天换液3次，透析后得到纯化的偶联磺胺氯哒嗪的载体蛋白溶液，冻干，-20°C保存，备用。
[0007]所述胶体金标记的磺胺氯哒嗪抗体采用如下方法制备:
在沸腾的0.01~0.02%氯金酸溶液中加入I %的新配制柠檬酸钠溶液，获得直径15-20nm的胶体金溶液，用0.lmol/L的K2CO3调节pH值至8.5~9.5，置2~8°C保存，备用；
以1:2000的标记比将待标记的磺胺氯哒嗪的单克隆抗体或多克隆抗体加入pH 8.5~
9.5的金溶胶中，标记IOmin后，加入20 %的PEG10000至终浓度为0.05%,4°C>1500~3000rpm离心20min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C、15000rpm离心Ih,弃上清,获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，获得胶体金标记的磺胺氯咕嗪抗体。
[0008]所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料制成。金标抗体纤维层用吸附磺胺氯哒嗪的金标抗体玻璃纤维棉制成。偶联磺胺氯哒嗪的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA或血蓝蛋白KLH。
[0009]检测印迹与对照印迹的排列组合为
【权利要求】
1.一种快速检测微量磺胺氯哒嗪的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，其特征是:吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层，在纤维素膜层上设有偶联磺胺氯哒嗪的载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的对照印迹，金标抗体为胶体金标记的磺胺氯哒嗪抗体。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:所述偶联磺胺氯哒嗪的载体蛋白溶液是通过以下方法得到的: 称取3.5 mg磺胺氯哒嗪钠置于10 mL螺口瓶中，用2mL 0.2mol/L的盐酸溶解；冰浴冷却后，避光边搅拌、边逐滴加入灭菌双蒸水溶解已预冷的I mol/L的NaNO2溶液，NaNO2溶液的用量以用淀粉碘化钾试纸检验呈蓝黑色为宜，4°C反应6h，得重氮化的磺胺氯哒嗪钠； 称取IOmg载体蛋白溶于I mL pH 7.2的PBS缓冲液中，预冷后边搅拌边逐滴加入重氮化的磺胺氯哒嗪钠，用I mol/L的NaOH调节pH至8_9，4°C过夜反应；反应产物在4°C搅拌下用PBS透析3天，每天换液3次，透析后得到纯化的偶联磺胺氯哒嗪的载体蛋白溶液，冻干，-20°C保存，备用。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征是:所述胶体金标记的磺胺氯哒嗪抗体采用如下方法制备: 在沸腾的0.01-0.02%氯金酸溶液中加入I %的新配制柠檬酸钠溶液，获得直径15-20nm的胶体金溶液， 用0.lmol/L的K2CO3调节pH值至8.5-9.5，置2-8°C保存，备用； 以1:2000的标记比将待标记的磺胺氯哒嗪的单克隆抗体或多克隆抗体加入pH 8.5-9.5的金溶胶中，标记IOmin后，加入20 %的PEG10000至终浓度为0.05%,4°C>1500-3000rpm离心20min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C、15000rpm离心Ih,弃上清,获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，获得胶体金标记的磺胺氯咕嗪抗体。
4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征是:吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料制成。
5.根据权利要求3所述的试纸条，其特征是:金标抗体纤维层用吸附磺胺氯哒嗪的金标抗体玻璃纤维棉制成。
6..根据权利要求3所述的试纸条，其特征是:偶联磺胺氯哒嗪的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA或血蓝蛋白KLH。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试纸条，其特征在于:检测印迹与对照印迹的排列组合为“ I I ”、“ + + ”、“u”、“丁丁”、“ h P’中的一种；在吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该样品标记线偏向吸附纤维层一侧约0.5cm处。
8.权利要求1所述磺胺氯哒嗪试纸条的制备方法，其特征是:该方法包括以下步骤: (O偶联磺胺氯咕嗪载体蛋白的制备 称取3.5 mg磺胺氯哒嗪钠置于10 mL螺口瓶中，用2mL 0.2mol/L的盐酸溶解；冰浴冷却后，避光边搅拌、边逐滴加入灭菌双蒸水溶解已预冷的I mol/L的NaNO2溶液，NaNO2溶液的用量以用淀粉碘化钾试纸检验呈蓝黑色为宜，4°C反应6h，得重氮化的磺胺氯哒嗪钠； 称取IOmg载体蛋白溶于I mL pH 7.2的PBS缓冲液中，预冷后边搅拌边逐滴加入重氮化的磺胺氯哒嗪钠，用I mol/L的NaOH调节pH至8_9，4°C过夜反应；反应产物在4°C搅拌下用PBS透析3天，每天换液3次，透析后得到纯化的偶联磺胺氯哒嗪的载体蛋白溶液，冻干，-20°C保存，备用； (2)抗磺胺氯咕嗪抗体的制备； (3)磺胺氯哒嗪金标抗体的制备； (4)羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体的制备； 用所得的磺胺氯哒嗪载体蛋白溶液在纤维素膜层上印制检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体在纤维素膜层上印制对照印迹；用磺胺氯哒嗪金标抗体制备金标抗体纤维层，然后依次按支撑层、吸附层和保护层的顺序组装成试纸条。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征是:所述磺胺氯哒嗪金标抗体制备方法如下: 在沸腾的0.01-0.02%氯金酸溶液中加入I %的新配制柠檬酸钠溶液，获得直径15-20nm的胶体金溶液，用0.lmol/L的K2CO3调节pH值至8.5-9.5，置2-8°C保存，备用； 以1:2000的标记比将待标记的磺胺氯哒嗪的单克隆抗体或多克隆抗体加入pH 8.5-9.5的金溶胶中，标记IOmin后，加入20 %的PEG10000至终浓度为0.05%,4°C>1500-3000rpm离心20min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C、15000rpm离心Ih,弃上清,获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，获得胶体金标记的磺胺氯咕嗪抗体。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征是:所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料制成；金标抗体纤维层用吸附磺胺氯哒嗪的金标抗体玻璃纤维棉制成；偶联磺胺氯哒嗪的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA或血蓝蛋白KLH。
【文档编号】G01N33/531GK103454420SQ201310333981
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月3日 优先权日:2013年8月3日
【发明者】张改平, 赵东, 王栋, 职爱民, 王方雨, 胡骁飞 申请人:河南百奥生物工程有限公司, 河南省农业科学院