生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法及其应用的制作方法

生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生鲜牛乳指纹图谱制备方法及其应用。所述制备方法包括液相质谱法和气相质谱法，分别独立包括步骤(1)待测样品提取和步骤(2)测试图谱生成，所述待测样品提取都包括待测样品上清液制备和样品提纯；所述液相色谱指纹图谱生成模式为电喷雾正离子模式(ES+)，全扫描质量范围100-1000mu；所述气相色谱指纹图谱生成模式为四级杆质谱，质量范围50-600mu，全扫描模式。为生鲜牛乳有害外源物质的快速筛查中建立适应生鲜乳成分的本底数据库，建立地区的生鲜乳成分的本底数据库、标准加入图谱库，对比筛查出生鲜乳样品中的部分有害药物、外源添加物的特征信息最终形成生鲜乳指纹库奠定了坚实的技术基础。
【专利说明】生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品分析技术，具体涉及一种色谱检测技术。
【背景技术】
[0002]利用色谱或者光谱技术对物质进行鉴定和分类是在最近几年提出的中药指纹图谱的基础上发展成熟起来的，其应用于液体食品检测也有相似之处。指纹图谱就是以物质的特异性和共性为基础，用图谱将物质的普遍性和唯一性展现出来并以此作为判断该物质的依据。指纹图谱具有以下特点:(I)特征性和专属性:通过指纹图谱能有效鉴别样品的真伪或产地；(2)可量化性:由主要特征峰的面积或比例，能有效控制样品质量.确保样品质量的相对稳定；(3)稳定性、重现性和再现性:由图谱采集环境或者分析测试手段决定的；(4)有效性:这应与产品相联系，并且在统计学上其数据有鉴别意义；(5)完整性:表现多成分之间的相互关系；(6)模糊性:成分间的协同交互作用复杂，采用模糊数学的分析手段解决实际问题。该技术中药成分鉴定中已经得到去全面推广。指纹图谱技术所具有的完整性、专属性、相对稳定性和模糊性，且能全面反映组成成分特征信息的鉴别能力也为开展生鲜乳这一成分复杂、有效成分不明确物质的伪劣鉴别和质量控制研究提供了技术基础。
[0003]生鲜奶(原料奶)是奶制品的源头，优质的生鲜奶供应是奶制品质量安全的根本保证。生鲜乳(原料乳)是一种营养丰富的食物。由于存在病原微生物污染，农药、兽药、激素、抗生素等残留，滥用添加剂，人为掺假等很多安全问题隐患，急需建立针对生鲜乳中有害物质尤其是未知药物(农药、兽药、激素)、添加物(添加剂、掺假等)的快速筛查技术。
[0004]建立生鲜乳的LC-MS (液质色谱)、GC-MS (气质色谱)指纹图谱提取技术，并依此提取技术建立了适应一定地区的生鲜乳成分的本底数据库、标准加入图谱库；对比筛查出生鲜乳样品中的部分有害药物、外源添加物的特征信息。并加载检索软件，最终形成开放式、图形统计、多任务查询和评价的生鲜乳指纹库，并将该方法应用于生鲜乳样品的实际筛查，将检测程序标准化，成为生鲜乳外源污染物检测的。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是:提供一种可用于建立适应一定地区的生鲜乳成分的本底数据库、标准加入图谱库；对比筛查出生鲜乳样品中的部分有害药物、外源添加物的特征信息，最终形成生鲜乳指纹库，并将该方法应用于生鲜乳样品的实际筛查的生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法及应用。
[0006]为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案为:
[0007]一种生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法，选自液相色谱质谱法和气相色谱质谱法中的一种。
[0008]上述生鲜牛乳的液相法色谱指纹图谱制备包括步骤(I)待测样品提取和步骤(2)测试图谱生成。
[0009]本发明的液相法的生鲜牛乳色谱指纹图谱制备方法中所述(I)待测样品提取步骤如下:
[0010]I)检测样品上清液制备:称取牛奶样品于聚乙烯离心管内，加入溶剂1，再加入氯化钠，涡旋混匀，超声离心，取全部上清液至另一支离心管内，同时加入脱水剂和吸附剂，涡旋振荡再离心，取上清液备用；
[0011]2)样品提纯:移取全部上清液旋蒸瓶中旋转浓缩至近干，以溶剂2溶解过滤膜后，上液相色谱质谱仪检测(LCMS)。
[0012]上述液相法的待测提取步骤中，溶剂I为乙腈，脱水剂为无水硫酸钠，吸附剂为C-18，溶剂2乙腈-水溶液。
[0013]上述液相法的待测提取步骤中，样品用量2.0?4.0ml，溶剂I用量为20ml，NaCl用量为2.0?4.0g，脱水剂用量为0.5?1.5g，优选1.0g，吸附剂用量为150?600mgy优选 300mg。
[0014]当取样量大时，无水硫酸钠的用量也较大(通常为样品量的2.5?3倍)，若用量不足易结块并包被目标物而造成损失的间题。因此本发明选择附加氯化钠提取，脱水方式除了采用经典脱水剂无水硫酸钠，还增加了吸附剂C-18。
[0015]本发明的生鲜牛乳的液相法色谱指纹图谱制备方法中，色谱指纹图谱的生成方法为:液相色谱质谱仪测试(LCMSMS):电喷雾正离子模式(ES+)，全扫描质量范围lOO-lOOOmu，毛细管电压3.0kV，源温100°C，脱溶剂气温度450°C，脱溶剂气流速550L/hr，反吹气流速300L/hr，电离电压25V ;进样量IOul。
[0016]本发明的液相色谱质谱指纹图谱法，分析条件为:梯度洗脱流动相选自乙腈、乙腈-0.1 %甲酸水溶液(梯度)、乙腈-0.lmmol/L乙酸铵水溶液，；梯度洗脱，流速0.15?
0.5ml/mim,优选0.25?0.35ml/mim ;上机溶样剂选自乙腈和乙腈-水(1:1)。
[0017]梯度洗脱条件为:总分析时间0.25?14min,优选IOmin ;流速0.12?0.35ml/min，优选0.25ml/min ;洗脱流动成分相配比为0.1 %甲酸水溶液:乙腈为95:5?5:95。
[0018]本发明生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法的气相法包括步骤(I)待测样品提取和步骤(2)测试图谱生成。
[0019]所述骤(I)待测样品提取包括:
[0020]I)样品上清液制备:称取牛奶样品于聚乙烯离心管内，加入溶剂1，加入氯化钠，涡旋混匀，超声离心，取全部上清液至另一支离心管内，同时加入脱水剂和吸附剂，涡旋振荡，再离心，取上清液备用；
[0021]2)样品提纯:移取全部上清液浓缩至近干，以溶剂3溶解，过滤膜后上气相色谱质谱仪测试(GCMS)。
[0022]上述气相法的待测样品提取提取步骤中，溶剂I为乙腈，脱水剂为无水硫酸钠，吸附为C-18，溶剂3为正己烷。
[0023]上述气相法的待测提取步骤中，样品用量2.0?4.0ml，溶剂I用量为20ml，NaCl用量为2.0?4.0g,脱水剂用量为0.5?1.5g，优选1.0g,吸附剂用量为150?300mg，优选 300mg。
[0024]使用正己烷溶解样品原因:1)使用气质主要分析弱极性物质，2)降低杂质干扰，利于挥发性物质分析。
[0025]本发明的生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法中，所述(2))测试图谱生成方法如下:气相色谱质谱仪测试(GCMS)采用四级杆质谱，质量范围50-600mu，全扫描模式，DB-5ms (30m*0.25mm*0.25um)毛细管色谱柱，进样口温度230°C，离子源温度230°C，四级杆温度150°C，传输线温度280°C，电离电压70eV，恒定流速1.5ml/min，氦气载气。
[0026]本发明的GCMS指纹图谱制备方法分析条件为:上机溶样剂选自正己烷、丙酮，优选正己烷；气化室温度选自150~220°C，优选220°C ;流动相流速为恒速，选自0.1~
0.2ml/min,优选0.15ml/min ;柱温升温程序选自方案I和方案2。
[0027]其中，方案I为:90min的80~290°C的五阶升温；方案2为58min的80~290°C的三阶升温:
[0028]方案I为
升温速率I阶段温度I运行时间
(°C/min) (°C) (min)
第一阶80O
第二阶15150O
第三阶52205
[0029]____
第四阶 324010
第五阶 326010
第六阶 329026
总时间90
[0030]方案2为:
升温速率I阶段温度I运行时间

(°C/min) (°C)(min)
第一阶80O
第二阶10220O
[0031]第三阶526010
第四阶529020
第五阶O
第六阶 O[0032]总时间58
[0033]方案I利于高分子物质分离
[0034]本发明还提供了生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法在生鲜牛乳检测中的应用，可用于病源微生物污染、农药、兽药、激素、添加物快速筛查中和建立适应生鲜乳成分的本底数据库、标准加入图谱库。
[0035]所述农药包括有机氯农药例如HCH、DDT、硫丹、五氯硝基苯等；有机磷农药例如毒死蜱、乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲胺磷、久效磷、甲基异柳磷等、拟除虫菊酯菊酯例如甲氰菊酯、氰戍菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯等；
[0036]所述兽药包括磺胺类抗生素例如磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺异恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间甲氧嘧啶等、内酰胺类抗生素例如苯唑西林、氯唑西林、青霉素G、青霉素V、四环素类抗生素例如四环素、土霉素、金霉素、激动剂类例如盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等、喹诺酮类抗菌药物例如环丙杀星、沙拉杀星、恩诺沙星、达氟沙星等;
[0037]添加物掺假物例如三聚氰胺。
[0038]本发明的有益效果是:
[0039]建立了生鲜乳的LC-MS (液质色谱)、GC-MS (气质色谱)指纹图谱提取技术；并依此提取技术建立了适应一定地区的生鲜乳成分的本底数据库、标准加入图谱库；可对比筛查出生鲜乳样品中的部分有害药物、外源添加物的特征信息，并通过检索软件加载，最终形成开放式、图形统计、多任务查询和评价的生鲜乳指纹库，并将该方法应用于生鲜乳样品的实际筛查。可同时完成多参数检测，可鉴别真伪，通过库检索，可以评价质量。将获取的指纹图谱在市售纯牛奶样品的筛查和检`测中初步应用，检测结果可为奶制品质量控制和有害物筛查技术研究提供方法学参考，所获得的指纹信息能在一定程度上反映原料奶的质量和外源微生物和有害物污染情况。
【专利附图】

【附图说明】
[0040]图1.生鲜牛乳液相色谱指纹图谱的本底谱图
[0041]图2.生鲜牛乳气相色谱指纹图谱的本底谱图
[0042]图3.生鲜牛乳磺胺类抗生素-磺胺吡啶的添加指纹图谱(RT:1.57min，添加浓度
0.lmmg/1，总离子色谱图，)
[0043]图4.生鲜牛乳磺胺类抗生素-磺胺吡啶的添加指纹图谱(RT:1.57min，添加浓度
0.lmg/1,:标准加入质谱图)
[0044]图5..生鲜牛乳磺胺类抗生素-磺胺吡啶的添加指纹图谱(RT:1.57min，添加浓度0.lmg/1，空白本底质谱图)
[0045]图6.生鲜牛乳环境激素类DDE的添加指纹图谱(RT: 18.490min,添加浓度0.2mg/1，总离子色谱图)
[0046]图7.生鲜牛乳环境激素类DDE的添加指纹图谱(RT: 18.490min,添加浓度0.2mg/1，标准加入质谱图)
[0047]图8.生鲜牛乳环境激素类DDE的添加指纹图谱(RT:18.490min，添加浓度0.2mg/I,空白本底质谱图)
[0048]图9.生鲜牛乳中农药类克百威的添加指纹图谱(RT:5.94min，添加浓度0.lmg/1,总离子色谱图)
[0049]图10.生鲜牛乳中农药类克百威的添加指纹图谱(RT:5.94min，添加浓度0.1mg/1，标准加入质谱图)
[0050]图11.生鲜牛乳中农药类克百威的添加指纹图谱(RT:5.94min，添加浓度0.1mg/
I,空白本底质谱图)
[0051]图12..生鲜牛乳激动剂类盐酸克伦特罗的添加指纹图谱(RT:2.52min，添加浓度0.lmg/1，总离子色谱图)
[0052]图13.生鲜牛乳激动剂类盐酸克伦特罗的添加指纹图谱(RT:2.52min，添加浓度0.lmg/1，标准加入质谱图)
[0053]图14.生鲜牛乳激动剂类盐酸克伦特罗的添加指纹图谱(RT:2.52min，添加浓度0.lmg/1，空白本底质谱图)
[0054]图15.生鲜牛乳中青霉素类抗生素-氯唑西林的添加指纹图谱(RT:8.22min,添加浓度0.lmg/1，总离子色谱图)
[0055]图16.生鲜牛乳中青霉素类抗生素-氯唑西林的添加指纹图谱(RT:8.22min,添加浓度0.lmg/1，标准加入质谱图)
[0056]图17.生鲜牛乳中青霉素类抗生素-氯唑西林的添加指纹图谱(RT:8.22min,添加浓度0.lmg/1，空白本底质谱图)
[0057]图18四环素类抗生素-四环素的添加指纹图谱(RT:2.05min，添加浓度0.lmg/1，总离子色谱图)
[0058]图19.四环素类抗生素-四环素的添加指纹图谱(RT:2.05min，添加浓度0.1mg/1，标准加入质谱图)
[0059]图20四环素类抗生素-四环素的添加指纹图谱(RT:2.05min，添加浓度0.lmg/1，空白本底质谱图)
[0060]图21.喹诺酮类抗菌药-氧氟沙星的添加指纹图谱(RT:1.69min，添加浓度0.lmg/1，总离子色谱图)
[0061]图22.喹诺酮类抗菌药-氧氟沙星的添加指纹图谱(RT:1.69min，添加浓度0.lmg/1, A:标准加入质谱图)
[0062]图23.喹诺酮类抗菌药-氧氟沙星的添加指纹图谱(RT:1.69min，添加浓度0.lmg/1，空白本底质谱图)
[0063]图24.生鲜牛乳中掺假物三聚氰胺的添加指纹图谱(RT:0.59min,添加浓度0.5mgh/l，总离子色谱图)
[0064]图25.生鲜牛乳中掺假物三聚氰胺的添加指纹图谱(RT:0.59min,添加浓度0.5mgh/l，标准加入质谱图)
[0065]图26.生鲜牛乳中掺假物三聚氰胺的添加指纹图谱(RT:0.59min,添加浓度0.5mgh/l，空白本底质谱图)
【具体实施方式】[0066]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0067]实施例1.生鲜牛乳气相法(GCMS)色谱指纹图谱本底谱图的制备
[0068]1.样品提取
[0069]I)称取4.0g牛奶样品于45mL聚乙烯离心管内，加入20mL乙腈，再加入4.0g氯化钠，润旋混勻15s,超声IOmin,以10000r/min、4°C离心IOmin,取全部上清液至另一支45mL离心管内，同时加入1.0g无水硫酸钠和300mgC-18吸附剂，涡旋振荡lmin，再以IOOOOr/min、4°C离心IOmin,取上清液备用。
[0070]2)移取全部上清液置250ml旋蒸瓶中，在25°C条件下减压旋转浓缩至近干，以IOml正己烷溶解，过0.22um滤膜后，上气相色谱质谱仪测试(GCM8)。
[0071]2.色谱指纹图谱生成:
[0072]四级杆质谱，质量范围50-600mu,全扫描模式，DB_5ms (30m*0.25mm*0.25um)毛细管色谱柱，进样口温度230°C，离子源温度230°C，四级杆温度150°C，传输线温度280°C，电离电压70eV，恒定流速1.5ml /min，氦气载气。柱箱升温梯度:80°C — 5 °C /min — 220°C (Omin) — 5°C /min — 260°C (IOmin) — 5°C /min — 290°C (20min)，总分析时间58min的三阶升温。
[0073]本底特征信息表GCMS法
[0074]
【权利要求】
1.一种生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法，其特征在于，选自液相色谱质谱法和气相色谱质谱法中的一种，所述液相色谱质谱法包括步骤(1)待测样品提取和步骤(2)测试图谱生成，所述步骤(1)待测样品提取包括:1)待测样品上清液制备:称取牛奶样品于聚乙烯离心管内，加入溶剂1，再加入氯化钠，涡旋混匀，超声离心，取全部上清液至另一支离心管内，同时加入脱水剂和吸附剂，涡旋振荡再离心，取上清液备用；2)样品提纯:移取全部上清液浓缩至近干，以溶剂2溶解，过滤膜后，上液相色谱质谱仪测试(LCMS)。
2.根据权利要求3的生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法，其特征在于I)所述溶剂I为乙腈，所述脱水剂为无水硫酸钠，所述吸附剂为C-18，2)所述溶剂2为乙腈-水溶液，所述I)待测样品上清液制备，所述样品用量2.0~4.0ml，所述乙腈用量为20ml，所述NaCl用量为2.0~4.0g，所述无水硫酸钠用量为0.5~1.5g，所述C-18用量为150~600mg，2)所述浓缩为旋蒸瓶中旋转减压低温浓缩。
3.根据权利要求2的生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法，其特征在于，(2)所述测试图谱生成方法如下:a.电喷雾正离子模式(ES+)，全扫描质量范围lOO-lOOOmu，毛细管电压3.0kV,源温100°C，脱溶剂气温度450°C，脱溶剂气流速550L/hr，反吹气流速300L/hr，电离电压 25V ;进样量 IOul，色谱柱 BEH C18 柱(2.l*50mm, 1.7um)。
4.根据权利要求3的生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法，其特征在于，(2)所述测试图谱生成方法，分析条件为，梯度洗脱，所述梯度洗脱流动相选自乙腈、乙腈-0.1 %甲酸水溶液(梯度)、乙腈-0.lm mol/L乙酸铵水溶液中的一种；流速0.15~0.上机溶样剂选自乙腈和乙腈-水(I: I)，所述梯度洗脱采用的洗脱条件为梯度洗脱条件为:流速0.12~0.5ml/min;洗脱流动成分相配比为0.1%甲酸水溶液:乙腈为95: 5~5: 95，总分析时间0.25~14min，所述气相色谱质谱法包括步骤(1)待测样品提取和步骤(2)测试图谱生成。
5.根据权利要求4的生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法，其特征在于，所述步骤(1)待测样品提取包括:1)样品上清液制备:称取牛奶样品于聚乙烯离心管内，加入溶剂1，再加入氯化钠，涡旋混匀，超声离心，取全部上清液至另一支离心管内，同时加入脱水剂和吸附剂，涡旋振荡，再离心，取上清液备用；2)样品提纯:移取全部上清液浓缩至近干，以溶剂3溶解，过滤膜后，上气相色谱质谱仪测试(GCMS)。
6.根据权利要求5的生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法，其特征在于，(I)所述溶剂I为乙腈，所述脱水剂剂为无水硫酸钠，所述吸附剂为C-18，(2)所述溶剂3为正己烷。
7.根据权利要求6的生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法，其特征在于，所述I)待测样品上清液制备的样品用量2.0~4.0ml，所述乙腈用量为20ml，所述NaCl用量为2.0~4.0g，所述无水硫酸钠用量为0.5~1.5g，所述C-18用量为150~600mg。
8.根据权利要求7的生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备技术，其特征在于，所述步骤(2)测试图谱生成方法如下:气相色谱质谱仪测试(GCMS)，四级杆质谱，质量范围50-600mu，全扫描模式，DB-5ms (30m*0.25mm*0.25um)毛细管色谱柱，进样口温度230°C，离子源温度230°C，四级杆温度150°C，传输线温度280°C，电离电压70eV，恒定流速1.5ml/min，氦气载气。
9.根据权利要求8的生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法，其特征在于，所述步骤(2)测试图谱生成的分析条件为:上机溶样剂选自正己烷、丙酮，优选正己烷；气化室温度选自150~220°C ;流动相流速为恒速，选自0.1~0.2ml/min ;柱温升温程序选自方案I和方案 2，所述方案 I 为 80°C— 15 °C /min — 150 °C ^ 5 °C /min — 220 °C (5min) — 3 °C /min — 240 °C (IOmin) 3 °C /min — 260 °C (IOmin) 3 °C /min — 290 °C (26min),总分析时间90min的五阶升温，所述方案2为80°C — 5 °C /min — 220 V (Omin) — 5 °C /min — 260°C (IOmin) — 5°C /min — 290°C (20min)，总分析时间 58min 的三阶升温。
10.权利要求1至9中任一项所述的生鲜牛乳的色谱指纹图谱制备方法在农药、兽药、激动剂、添加物快速筛查中的应用。
【文档编号】G01N30/06GK103698415SQ201310404285
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年8月31日 优先权日:2013年8月31日
【发明者】张福金, 张欣昕, 姚一萍, 侯德坤, 李国银, 冯小惠, 连海飞, 任超, 莎那 申请人:内蒙古农牧业科学院