一种三步体外技术测定养分小肠消化率的方法
【专利摘要】本发明提出一种三步体外技术测定养分小肠消化率的方法，包括，瘤胃培养，酸处理，胰液培养三个步骤，本发明三步体外法技术中改变现有技术利用胰酶进行饲料处理的方法，直接使用胰液进行处理，除了能用来消化降解饲料样本中的瘤胃非降解饲料蛋白(RUP)外，本发明所采用的胰液法还为反刍动物小肠淀粉消化率、脂肪消化率的评价提供了一个很好的途径。通过一次三步体外法就可以模拟出反刍动物对饲料中蛋白质、淀粉、脂肪的消化情况，测出蛋白质、淀粉、脂肪小肠消化率三个重要指标。操作简单，易于实现且节约成本。
【专利说明】一种三步体外技术测定养分小肠消化率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种反刍动物小肠消化率测定方法，特别涉及一种采用胰液的三步体外技术测定养分小肠消化率的方法。
【背景技术】
[0002]在反刍动物小肠中，可代谢蛋白质是由瘤胃合成的微生物蛋白、瘤胃非降解饲料蛋白(RUP)及少量内源蛋白构成。研究表明，微生物蛋白小肠消化率基本是固定的(80% -85% )，但是RUP小肠消化率受饲料类型、饲料来源及加工方式等因素影响。饲料RUP小肠消化率是影响奶牛的产奶量、生产性能的重要参数。
[0003]目前，蛋白评价系统对不同饲料的RUP小肠消化率均采用固定值，在英国饲料评价系统、NRC体系中，所有饲料的RUP小肠消化率分别均为90%、80%。这种状况对不同饲料显然具有很大局限性。目前，测定饲料RUP小肠消化率主要有移动尼龙袋法、三步体外法。移动尼龙袋法由于存在操作成本高、过程复杂、与实际食糜移动速率存在差异等缺点不易广泛应用。三步体外法是在特定温度和PH条件下用一种酶或多酶复合物培养饲料样品。三步体外法技术I)尽量的模拟反刍动物的生理条件，包括瘤胃发酵的潜在影响；2)拥有快速、可靠、廉价的特点；3)适用广泛的蛋白质补充物。4)准确的反应不同蛋白质的消化。所以，目前三步体外法常被用来作为评价反刍动物饲料RUP小肠消化率的方法。
[0004]目前常用三步体外法中所使用的是胰酶(SigmaP-7545)。
[0005]胰酶(Sigma P-7545)主要包含有糜蛋白酶、胰蛋白酶。
[0006]该胰酶的使用方法是:配置成pH值为7.8的磷酸缓冲溶液，其中包含有50ppm百里酚、3g/L胰酶(Sigma P-7545)。在三步体外法中第三步胰酶培养过程中，取13.5ml该溶液与0.5ml、lmol/L的NaOH溶液加入到培养物进行培养。
[0007]该方法只能用来消化降解饲料样本中的瘤胃非降解饲料蛋白(RUP)，测定出反刍动物小肠蛋白质消化率这一个反刍动物饲料营养价值的指标。但这种方法不能测定小肠淀粉和脂肪的消化率，无法全面评价某种饲料的营养价值，并且无法消除饲料中淀粉和脂肪对蛋白质消化率的影响。
【发明内容】
[0008]为解决上述现有技术存在的缺陷，本发明提出一种三步体外技术测定养分小肠消化率的方法，本发明三步体外法技术中直接使用胰液进行处理，不仅能用来消化降解饲料样本中的瘤胃非降解饲料蛋白(RUP)，还能消化通过瘤胃的饲料中的淀粉和脂肪，可以测定出反刍动物小肠蛋白质消化率、淀粉消化率、脂肪消化率，评价出三个反刍动物饲料营养价值的重要指标。
[0009]为达到上述目的，本发明一种三步体外技术测定养分小肠消化率的方法，其具体步骤为:
[0010]I)、瘤胃培养[0011]称取约15g饲料，装入9cmX15cm的尼龙袋中，悬吊在瘤胃中16小时，培养后，用自来水冲洗袋子至流水澄清，并且55°C干燥48小时，取出袋子中残余样本，并测定N含量、淀粉含量、脂肪含量；
[0012]2)、酸处理
[0013]称0.6?0.7g残余的样本,放入50ml离心管,加入10ml>pH值为1.9的0.1mol/L的HCl溶液，38°C水浴振荡培养I小时；
[0014]3)、胰液培养
[0015]利用胰液培养，培养完成后，离心管立即加入3ml、100% (wt/vol) TCA溶液，停止酶的作用并沉淀未消化的蛋白质，以10000转/分钟离心15分钟；
[0016]测定沉淀物中N含量、淀粉含量、脂肪含量；
[0017]通过步骤I)中N含量、淀粉含量、脂肪含量与步骤3)中同种物质含量比值的百分率得出饲料样本的蛋白质、淀粉、脂肪小肠消化率。
[0018]所述步骤3)中胰液培养的具体操作为:培养物中加入13.5ml的磷酸缓冲液，再用lmol/1的NaOH溶液将培养液pH值调至7.6，再加入胰液2.5ml，38°C水浴振荡培养24小时。
[0019]所述胰液来自于安装胰液收集管的阉牛、奶牛或羊，获取后4°C保存至实验室，备用。
[0020]相对于现有技术，本发明的有益效果为:本发明所采用的胰液法完全可以代替目前常用的胰酶法用于三步体外法培养技术，且能够更准确地评价反刍动物各种饲料的小肠蛋白质消化率。
[0021]同时，本发明所采用的胰液法为反刍动物小肠淀粉消化率、脂肪消化率的评价提供了一个很好的途径。通过一次三步体外法就可以模拟出反刍动物对饲料中蛋白质、淀粉、脂肪的消化情况，测出蛋白质、淀粉、脂肪小肠消化率三个重要指标。操作简单，易于实现且节约成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为胰液加入量和培养时间对体外蛋白质消化率的影响。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图及【具体实施方式】对本发明做进一步详细描述:
[0024]本发明一种三步体外技术测定养分小肠消化率的方法，其具体步骤为:
[0025]I)、瘤胃培养
[0026]称取约15g饲料,装入9cmX15cm的尼龙袋中，悬吊在瘤胃中16小时,培养后,用自来水冲洗袋子至流水澄清，并且55°C干燥48小时，取出袋子中残余样本，并测定N含量、淀粉含量、脂肪含量；
[0027]2)、酸处理
[0028]称0.6?0.7g残余的样本，放入50ml离心管,加入10ml>pH值为1.9的0.1mol/L的HCl溶液，38°C水浴振荡培养I小时；
[0029]3)、胰液培养[0030]利用胰液培养，培养完成后，离心管立即加入3ml、100% (wt/vol) TCA溶液，停止酶的作用并沉淀未消化的蛋白质，以10000转/分钟离心15分钟；
[0031]测定沉淀物中N含量、淀粉含量、脂肪含量；
[0032]通过步骤I)中N含量、淀粉含量、脂肪含量与步骤3)中同种物质含量比值的百分率得出饲料样本的蛋白质、淀粉、脂肪小肠消化率。
[0033]所述步骤3)中胰液培养的具体操作为:培养物中加入13.5ml的磷酸缓冲液，再用lmol/1的NaOH溶液将培养液pH值调至7.6，再加入胰液2.5ml，38°C水浴振荡培养24小时。小肠内的PH —般介于7.2-8.0，所以使用磷酸缓冲液和NaOH溶液将pH调到7.6以有利于消化酶活性的发挥。依据试验研究，最佳胰液加入量为2.5ml (图1)。
[0034]所述胰液来自于安装胰液收集管的2只周岁阉牛，体重为350kg，获取2只阉牛的胰液，等比例混合，4°C保存至实验室，备用。
[0035]国际上公认的测定蛋白质小肠消化率的方法为胰酶法。如图1所示，胰酶(SigmaP-7545)法测定的蛋白质小肠消化率为91.8% (叉号表示)；本发明中所采用的2.5ml胰液培养24小时的胰液培养方法测定的蛋白质小肠消化率为93.2% (正方好表不),与胰酶法测定值差异不显著(P > 0.10)。采用Iml (菱形号)或5ml (三角号)胰液测定的消化率与胰酶法不符。
[0036]如表1所示，本发明所采用的胰液法与目前常用的胰酶(Sigma P-7545)法对体外蛋白质消化率没有影响(P > 0.10)。各种原料样本均表示两种方法之间差异不显著。
[0037]表1酶法和胰液法对体外蛋白质饲料蛋白质消化率的比较
[0038]
【权利要求】
1.一种三步体外技术测定养分小肠消化率的方法，其具体步骤为: 1)、瘤胃培养 取适量饲料，装入尼龙袋，悬吊在瘤胃中16小时，培养后，用自来水冲洗袋子至流水澄清，并且55°C干燥48小时，取出袋子中残余样本，并测定N含量、淀粉含量、脂肪含量； 2)、酸处理 称0.6?0.7g残余的样本,放入50ml离心管,加入IOml> pH值为1.9的0.lmol/L的HCl溶液，38°C水浴振荡培养I小时； 3)、胰液培养 利用胰液培养，培养完成后，离心管立即加入3ml、100% (wt/vol)TCA溶液，停止酶的作用并沉淀未消化的蛋白质，以10000转/分钟离心15分钟； 测定沉淀物中N含量、淀粉含量、脂肪含量； 通过步骤I)中N含量、淀粉含量、脂肪含量与步骤3)中同种物质含量比值的百分率得出饲料样本的蛋白质、淀粉、脂肪小肠消化率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中胰液培养的具体操作为:培养物中加入13.5ml的磷酸缓冲液，再用lmol/1的NaOH溶液将培养液pH值调至7.6，再加入胰液2.5ml，38°C水浴振荡培养24小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胰液来自于安装胰液收集管的阉牛、奶牛或羊，获取后4°C保存至实验室，备用。
【文档编号】G01N33/00GK103760305SQ201410016733
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】徐 明, 高明 申请人:徐 明