猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有：依次连接的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其中，由保藏号为CGMCCNo.7710的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05-D10作为金标抗体偶联胶体金并喷涂于金标垫上，由保藏号为CGMCCNo.7712的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05-F10作为检测抗体并喷涂于NC膜上形成检测线。另外，本发明还提供了猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品猪霍乱沙门氏菌中的应用。实验结果显示本发明的试纸条对猪霍乱沙门氏菌的检测特异性和灵敏性均较高。
【专利说明】猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种免疫胶体金检测试纸条，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002]猪霍乱沙门氏菌(Shigella boydii)属于志贺氏菌C群，是一种重要的食源性致病菌，可通过受污染的肉、蛋、鱼及其制品等动物性产品，瓜子仁等进入人体，引起发热、腹痛、里急后重，有时表现为全身中毒症状为中毒性痢疾，治疗不彻底转为慢性。
[0003]目前猪霍乱沙门氏菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但国内外目前尚无可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以猪霍乱沙门氏菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条。
【发明内容】
[0004]为解决上述问题，本发明提供了一种猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有:依次连接的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其中，由保藏号为CGMCCN0.7710的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05-D10作为金标抗体偶联胶体金并喷涂于金标垫上，由保藏号为CGMCCN0.7712的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05_F10作为检测抗体并喷涂于NC膜上形成检测线。
[0005]另外，本发明还提供了猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品猪霍乱沙门氏菌中的应用。
[0006]发明作用与效果
[0007]根据本发明的猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条，由于采用了新筛选的配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果显示本发明的试纸条对猪霍乱沙门氏菌的检测特异性和灵敏性均较高。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的单抗SDS-PAGE电泳图；
[0009]图2是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体金pH结果；
[0010]图3是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联
胶体金结合量结果；
[0011]图4是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体组合配对结果；
[0012]图5是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条灵敏度结果；
[0013]图6是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条交叉反应结果；
[0014]图1是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条模拟带菌实验结果；
[0015]图8是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图。
[0016]保藏信息:
[0017]1.分泌猪霍乱沙门氏菌单克隆抗体Mab05_D10的杂交瘤细胞株抗猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)杂交瘤细胞株,于2013年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101。
[0018]保藏号:CGMCCN0.7710。
[0019]2.分泌猪霍乱沙门氏菌单克隆抗体Mab05_F10的杂交瘤细胞株抗猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)杂交瘤细胞株,于2013年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101
[0020]保藏号:CGMCCN0.7712。
【具体实施方式】
[0021]以下结合附图介绍本发明的【具体实施方式】:
[0022]首先介绍本发明实施例中所使用的试剂与仪器:
[0023]主要试剂
[0024]弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、PEG、TWEEN-20Sigma ；BSA购于上海世泽生物科技有限公司；胶体金溶液购于上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)135SMillipore ;羊抗鼠、HRP-羊抗鼠、羊抗兔购于上海生工生物工程股份有限公司；单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购于ZYMEDCat:90-6550; Lot.60907259。本发明中用于做交叉反应实验的菌株均可通过商业途径获得。
[0025]主要仪器
[0026]酶标仪SpectraMax M2 购自 Molecular Devices ;Nanodrop2000C 购自 ThermoScientific ;点样仪AD6010购自B10-D0T ;扫描仪Phantom V9购自MICROTEK ;恒温培养摇床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪BioLogic?LP358BR5057购自BIO-RAD ;单人净化工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。
[0027]—、猪霍乱沙门氏菌单克隆抗体制备
[0028]1.免疫原和阳性标准品的准备
[0029]猪霍乱沙门氏菌(CICC21493 )接种于蛋白胨水(BPW)，37 °C、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3%甲醛溶液室温灭活I天。用生理盐水调整猪霍乱沙门氏菌(CICC21493)浓度至5X 109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为108cfu/ml作为阳性对照标准品，蛋白胨水(BPW)为阴性对照标准品。
[0030]2.单克隆抗体的制备过程
[0031]I)实验动物:选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。[0032]2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。
[0033]3)米血:3次加强免疫后从尾部静脉米血，米用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0034]4)细胞融合:取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5%C02培养箱培养。
[0035]5)杂交瘤细胞筛选:采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。
[0036]6)克隆培养及抗体制备:用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 — 4次，直至阳性率达到100%。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6个杂交瘤细胞，7~10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化抗体。
[0037]筛选出2株稳定分泌抗猪霍乱沙门氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为Mab05-D10 (CGMCCN0.7710，简称 D10)和 Mab05_F10 (CGMCC) N0.7712，简称 F10)，经过初步抗体配对实验后，对DlO和FlO进行亚类及亚型鉴定、测定浓度、相对分子质量，并对制备的单克隆抗体通过交叉反应进行特异性验证。
[0038]3.单克隆抗体的亚型鉴定 [0039]通过单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定各抗体亚类、亚型，表1结果为显色终止后450nm处OD值，由表2可得，D10、F10亚类均为IgGl，轻链亚型为κ。
[0040]表1单克隆抗亚类、亚型结果
[0041]
【权利要求】
1.一种猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有: 依次连接的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫， 其中，由保藏号为CGMCCN0.7710的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05_D10作为金标抗体偶联胶体金并喷涂于所述金标垫上，由保藏号为CGMCCN0.7712的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05-F10作为检测抗体并喷涂于所述NC膜上形成检测线。
2.如权利要求1所述的猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品猪霍乱沙门氏菌中的应用。
【文档编号】G01N33/577GK103941006SQ201410065283
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年2月25日 优先权日:2014年2月25日
【发明者】刘箐, 刘程 申请人:上海理工大学