基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法，本发明设计了1对引物用于扩增MYOD1基因5′调控区的启动子区片段，将胶回收产物用T-载体PCR产物克隆试剂盒构建含有目的片段的重组质粒，然后利用Promoter-BindingTFProfilingAssayI和NuclearExtractionKit（CatalogNumberSK-0001）进行MYOD1基因启动子区转录因子结合位点的筛选，便于对牛MYOD1基因启动子的调控方式及调控元件进行研究。本发明的方法具有灵敏度高、检测速度快、操作简单、同时筛选多种转录因子、不需使用放射性同位素等优点。
【专利说明】基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子遗传学、蛋白质组学领域，尤其是一种基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法。
【背景技术】
[0002]真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。某些特定基因表达的调节由转录因子特异性结合于调控区相关元件，成为转录起始的关键步骤，并最终导致基因的时间和空间表达。编码组织特异蛋白的基因严格按照组织特异性和发育阶段性表达，为基因表达调控机制提供了很好的研究|吴式。在特异闻效表达的转基因动物中，获得能广泛应用的特异性启动子非常重要。但启动子的特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。
[0003]/的全称为myogenic differentiation I，其中文名称为生肌决定因子，是骨骼肌生长发育过程中重要的正调控基因，在肌肉特异基因转录调控中，MyoD /起着总开关的作用，可以结合到肌细胞生成素(myogenin)、肌酸激酶CK、肌球蛋白、结蛋白等基因启动子区发挥重要调控作用，促进它们的转录激活。生肌决定因子/的主要功能包括:促使静止期的肌卫星细胞向成肌细胞转化；能把许多种类型细胞转化为成肌细胞，并可促进成肌细胞进一步融合、分化为成熟的肌纤维。
[0004]MyoD I介导的肌分化机制作为研究细胞分化的最佳模型，已成为当前众多学者研究的焦点。目前，国内外对该基因的表达调控在小鼠、鸡和猪的肌细胞生成机理等方面的相关研究较多，在牛上已有一些研究，包括遗传变异及功能研究等，但主要集中在转录后和翻译水平，/基因转录调控的分子机制尚不清楚。因此，筛选/基因启动子的转录因子结合位点为探究/基因的转录调控有一定的意义，为转基因牛的培育和牛肉品质的提闻提供理论依据。MyoD /基因启动子的研究具有广阔的研究如景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是:提供一种基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法，它具有灵敏度高、检测速度快、检测种类多、操作简单等优点，克服了凝胶迁移试验和构建一系列启动子缺失或突变的报告体的复杂性。
[0006]本发明是这样实现的:基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法，包括以下步骤:
步骤I)进行目的片段的克隆，构建含有目的片段的T载体:根据NCBI上牛MYODl基因的序列进行启动子的生物信息学分析，找到该基因的转录起始位点，并预测其启动子区；然后根据5，调控区序列设计I对两端引物，以基因组DNA为模板，利用PCR反应进行扩增，获得目的片段；对目的片段进行胶回收纯化；再将纯化的目的片段与PUCm-T载体连接过夜；过夜后将连接体系转化DH5 α感受态细胞，然后进行铺板培养过夜；步骤2)重组质粒的鉴定:挑取上述平板上的白斑单菌落进行摇菌培养过夜，然后提取质粒进行per，将per产物送出测序；将测序结果与NCBI上的序列进行比对，利用测序正确的质粒为模版进行目的片段的大量扩增，然后进行胶回收并纯化；将测序正确的质粒菌液加甘油后_80°C保存；
步骤3:目的片段的浓缩:将上述回收纯化的目的片段混到一起，然后加2倍目的片段总体积的无水乙醇、与目的片段总体积相等的异丙醇，以及浓度为3mol/l的目的片段总体积的1/10的醋酸钠，然后混匀沉淀30分钟之后，在转速为12000-15000rpm/min的条件下，离心3-5min，去除上清液；加质量百分比为75%的乙醇Iml，用这些乙醇冲洗管壁直至混匀，然后在转速为12000-15000rpm/min的条件下,离心3-5min,去除上清液；重复一次,然后将管子倒扣在纸上晾干，直至无乙醇味；用ddH20溶解，并冲洗管壁振荡混匀，测其浓度；
步骤4)细胞核提取物的提取:利用Nuclear Extraction Kit试剂盒提取牛肌肉组织的细胞核提取物，并利用BCA蛋白定量试剂盒对所提的细胞核提取物进行浓度测定；
步骤5)牛#76497基因启动子区转录因子结合位点的预测:利用Promoter-Binding TFProfiling Assay I所提的细胞核提取物和回收纯化后浓缩的目的片段进行牛基因启动子区的转录因子结合位点的筛选实验，实验结束后，对实验结果进行分析处理，即完成了基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选。
[0007]单--次试验可明确48种TF与特定启动子的结合，
由于采用了上述技术方案，本发明设计了 I对引物用于扩增基因5'调控区的启动子区片段，将胶回收产物用T-载体PCR产物克隆试剂盒构建含有目的片段的重组质粒，然后利用Promoter-Binding TF Profiling Assay I和Nuclear Extraction Kit (CatalogNumber SK-0001)进行MY0D1基因启动子区转录因子结合位点的筛选，便于对牛MY0D1基因启动子的调控方式 及调控元件进行研究。本发明的方法具有灵敏度高、检测速度快、操作简单、同时筛选多种转录因子、不需使用放射性同位素等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为从牛肌肉组织中提取的DNA的电泳示意图；
图2为本发明中的以图1中的DNA为模板进行的/基因5'调控区启动子区片段的per扩增的电泳示意图；
图3为本发明中的图2中的per产物的胶回收产物的电泳示意图；
图4为构建的重组T载体质粒的电泳示意图；
图5为以重组T载体质粒为模板进行的/基因5'调控区启动子区片段的per扩增的电泳示意图；
图6为图5中的per产物的胶回收产物的电泳示意图。
【具体实施方式】
[0009]本发明的实施例:基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法，具体如下:
一、菌株、质粒以及试剂的准备
菌株:大肠杆菌感受态细胞DH5 α购自大连Takara公司；Promoter-Binding TF Profiling Assay I 和 Nuclear Extraction Kit (CatalogNumber SK-0001 )试剂盒购自 Signosis 公司；
试剂来源:2XEs Taq MasterMix和BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪公司；质粒小量抽提试剂盒、动物组织DNA提取试剂盒、T-载体PCR产物克隆试剂盒、、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工；其他试剂均为国产分析纯。
[0010]试剂配制:
Amp (100 mg/ml):称取Ampicillin 5g,加50ml超纯水溶解,0.22 μ m过滤除菌后,按I ml/份分装，-20 °C保存。
[0011]IPTG贮存液(0.1 M):称取IPTG 0.6g，用超纯水溶解定容至25 ml, -20°C冷冻保存。
[0012]X-gal (20mg/ml):称取 0.4gX_gal (5_ 溴 ~4~ 氯 _3_ 口引哚-β -D-半乳糖苷)粉末，溶于二甲基甲酰胺，定容至20ml。0.22 μ m过滤除菌后，按I ml/份分装于1.5ml离心管，用铝箔封裹避光保存于_20°C。
[0013]LB液体培养基:称取胰蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCl lg，置于100ml三角瓶中，加入95ml超纯水溶解，调pH值至7.0，加超纯水至总体积为100ml，121 1:高压灭菌30min,冷却至室温,临用时加入抗生素,氨节青霉素工作浓度为100 μ g/ml。
[0014]LB固体培养基:称取胰蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCl lg，细菌用琼脂1.5g置于100mL三角瓶中，加入95ml超纯水溶解，调pH值至7.0，加超纯水至总体积为100ml，高压灭菌后冷却至45°C左右,加入抗生素(100 μ g/ml),摇匀后倒入培养皿。
SOC培养基:称取胰蛋白胨2g，酵母提取物0.5g，加0.05%的NaCl，2.5 mM KCl，10 mMMgC12, 20 mM葡萄糖配制成100 ml。
[0015]PBS 缓冲液:KC1 0.29，KH2P040.2g, NaCl 8.0g, Na2HP04.12H20 2.88g,溶于900ml超纯水中，调pH值至7.0-7.2，定容至1000ml，121 °C高压灭菌30 min后4°C保存。
[0016]二、重组质粒的构建
步骤1、牛/基因启动子T载体重组质粒的构建
1.根据牛/基因5'调控区序列设计一组两端引物，上游引物的序列是5'-ACCTCCCGACATCATACATT-3'，下游引物的序列为:5' - GGTTTGGGTTGCTAGACG-3'。
[0017]2.以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增。
[0018]反应条件为:在94°C变性2min，再在94°C循环30s，然后在59°C退火30s，再在72°C延伸80s，进行35个循环，最后在72°C最终延伸2min。
[0019]3.反应结束后，取5 μ I反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0020](I)加入I g的琼脂糖至100ml I X TAE电泳缓冲液中。
[0021](2)微波炉中加热使琼脂糖完全溶解，溶液冷却至60°C (手背接触三角瓶壁不烫手),加入Goldview染料5微升,轻轻摇匀。
[0022](3)倒胶,厚度为0.3-0.5cm,然后放置好梳子。
[0023](4)待胶冷却后，轻轻拔掉梳子，置于电泳槽中，加电泳缓冲液至完全覆盖胶面。
[0024](5)上样，电泳，稳压 100V，30_40min。
[0025](6)取出凝胶，在紫外灯下检查凝胶，并用凝胶成像系统记录结果。
[0026]4.琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物。[0027](I) PCR产物目的条带的切割和称重，并按每IOOmg琼脂糖中加入300-600 μ I的溶胶液Buffer B2,充分混匀。
[0028](2) 50°C水浴5-10min，间或混匀，直至胶完全熔化，将所得溶液转移至吸附柱中，8000 Xg室温离心30秒，弃上清。
[0029](3)将吸附柱中加入500μ I漂洗液，9000Xg室温离心30妙，弃上清。
[0030](4)重复步骤(3) —次。
[0031](5)将吸附柱于9000Xg室温离心I分钟，除去残留的漂洗液，将吸附柱室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。
[0032](6)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，向吸附柱中间部分滴加15-40 μ lddH20,室温静置1-2分钟。9000Xg室温离心I分钟洗脱DNA，收集管中溶液，将所得到的DNA溶液置于-20度保存或用于后续试验。
[0033]5.牛MyoD /基因启动子T载体重组质粒的构建
利用T-载体PCR产物克隆试剂盒进行牛基因启动子T载体重组质粒的构建，反应体系如下:
胶回收的PCR产物3μ1
pUCm-T 载体I μ I
IOXLigation BufferI μ I
50%PEG 4000I μ I
Sterilized ddH203 μ I
T4 DNA LigationI μ I
混匀，16 °C连接过夜
6.连接产物转化DH5a菌株 转化的步骤如下:
(I)取100 μ I感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
[0034](2)将上述的连接液全部加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30分钟。
[0035](3) 42°C水浴热激90秒，冰上放置15-20分钟。
[0036](4)加 400 μ ISOC 培养基，37°C 200_250rpm 振荡培养 I 小时。
[0037](5)室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400 μ I上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
[0038](6)将细菌涂布在预先用20 μ IlOOMm IPTG和100 μ I 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上。
[0039](7)平板在37°C下正向放置I小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
[0040]步骤2、重组质粒的筛选、鉴定
(I)蓝白斑的筛选培养:挑取上述固体培养基上的白色单菌落于装有5ml含有终浓度为20mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37°C 200rpm/h的培养箱中摇菌培养过夜。
[0041](2)利用质粒DNA小量抽提试剂盒提取重组质粒，并进行电泳检测。
[0042](3)以重组质粒为模板进行关岭牛MYODl基因启动子得PCR克隆，并将PCR产物进行电泳检测。
[0043](4)将有目的条带的PCR产物送到英维捷基(上海)贸易有限公司测序，并将测序结果与NCBI上的序列进行比对。
[0044](5)利用测序正确的质粒为模板进行目的片段的大量扩增，并将PCR产物进行胶回收。
[0045]步骤3、目的片段的浓缩
将上述回收纯化的目的片段混到一起，然后加2倍体积的无水乙醇、等体积的异丙醇和十分之一体积的3mol/l醋酸钠，然后混匀沉淀30分钟之后12000-15000rpm/min离心3-5min，去除上清液；加75%的乙醇1ml，不断用75%的乙醇冲洗管壁混匀，然后同上离心3-5min，去除上清液；重复一次，然后管子倒扣在纸上晾干，直至无乙醇味；用ddH20溶解，并冲洗管壁振荡混匀，并测其浓度。
[0046]步骤4、利用 Nuclear Extraction Kit (Catalog Number SK-0001 )试剂盒提取关岭牛肌肉组织的细胞核提取物，并利用BCA蛋白定量试剂盒对所提的细胞核提取物进行浓度测定。
[0047]步骤5、利用Promoter-Binding TF Profiling Assay 1、所提的细胞核提取物和大量回收纯化的目的片段进行牛基因启动子区转录因子结合位点的筛选实验。
[0048]步骤6、数据分析 将实验结果按以下方式处理:
对照组处理结果=对照组结果的平均值-空白组的平均值；
实验组处理结果=实验组结果的平均值-空白组的平均值；
判断值=对照组处理结果/实验组处理结果
如果判断值大于3就说明启动子区含有相应的转录因子结合位点。利用Promoter-Binding TF Profiling Assay I试剂盒和前面纯化浓缩的目的片段以及细胞核提取物进行牛/基因启动子区的转录因子结合位点的筛选，数据处理结果如表1所示。从结果中我们可以初步判定/基因启动子区有以下的转录因子结合位点。
【权利要求】
1.一种基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤I)进行目的片段的克隆，构建含有目的片段的T载体:根据NCBI上牛MYODl基因的序列进行启动子的生物信息学分析，找到该基因的转录起始位点，并预测其启动子区；然后根据5，调控区序列设计I对两端引物，以基因组DNA为模板，利用PCR反应进行扩增，获得目的片段；对目的片段进行胶回收纯化；再将纯化的目的片段与PUCm-T载体连接过夜；过夜后将连接体系转化DH5 α感受态细胞，然后进行铺板培养过夜； 步骤2)重组质粒的鉴定:挑取上述平板上的白斑单菌落进行摇菌培养过夜，然后提取质粒进行per，将per产物送出测序；将测序结果与NCBI上的序列进行比对，利用测序正确的质粒为模版进行目的片段的大量扩增，然后进行胶回收并纯化；将测序正确的质粒菌液加甘油后_80°C保存； 步骤3:目的片段的浓缩:将上述回收纯化的目的片段混到一起，然后加2倍目的片段总体积的无水乙醇、与目的片段总体积相等的异丙醇，以及浓度为3mol/l的目的片段总体积的1/10的醋酸钠，然后混匀沉淀30分钟之后，在转速为12000-15000rpm/min的条件下，离心3-5min，去除上清液；加质量百分比为75%的乙醇1ml，用这些乙醇冲洗管壁直至混匀，然后在转速为12000-15000rpm/min的条件下,离心3-5min,去除上清液；重复一次,然后将管子倒扣在纸上晾干，直至无乙醇味；用ddH20溶解，并冲洗管壁振荡混匀，测其浓度； 步骤4)细胞核提取物的提取:利用Nuclear Extraction Kit试剂盒提取牛肌肉组织的细胞核提取物，并利用BCA蛋白定量试剂盒对所提的细胞核提取物进行浓度测定； 步骤5)牛#76497基因启动子区转录因子结合位点的预测:利用Promoter-Binding TFProfiling Assay I所提的细胞核提取物和回收纯化后浓缩的目的片段进行牛基因启动子区的转录因子结合位点的筛选实验，实验结束后，对实验结果进行分析处理，即完成了基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选。
【文档编号】G01N33/68GK103869081SQ201410094856
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月16日 优先权日:2014年3月16日
【发明者】许厚强, 张雯, 陈伟, 陈祥, 赵佳福, 桓聪聪 申请人:贵州大学