α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型及筛选方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型及筛选方法和应用，以马铃薯淀粉为底物，α-葡萄糖苷酶与马铃薯淀粉底物的水解产物葡萄糖采用3,5-二硝基水杨酸法测定其标准曲线，其技术操作简单；采用提取自根霉的III型α-葡萄糖苷酶，其相比于提取自酵母的Ⅰ型α-葡萄糖苷酶更为经济，成本低廉；筛选模型的有效性采用阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制曲线进行验证，筛选抑制剂的灵敏度更高，IC50值为0.00656mmol/L。α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选方法，包括步骤1：建立上述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型；步骤2：将天然产物提取物或中药提取物，加入到步骤1的筛选模型中反应并计算酶活性抑制率，筛选出酶活性抑制率较大的组分。
【专利说明】α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型及筛选方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明公开一种α -葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型及筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002]糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是以持续高血糖为基本生化特征一种综合病症，主要系由体内胰岛素相对或绝对不足所引起糖代谢紊乱所致。糖尿病主要有两种类型:I型糖尿病又称胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，约占糖尿病发病率的5% ； II型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，约占糖尿病发病率的95%。
[0003]目前临床上常用的口服降血糖药物主要有硫脲类、双胍类、苯甲酸衍生物类、葡萄糖苷酶抑制剂类和噻唑烷二酮类。葡萄糖苷酶抑制剂类为第四类治疗糖尿病的药物，药物开发目前主要是集中在对II型糖尿病的治疗研究上。现已上市的α-葡萄糖苷酶抑制剂有阿卡波糖、米格列醇(Miglitol)和伏格列波糖(倍欣Voglibose)三种，已成为治疗II型糖尿病的首选药和I型糖尿病的胰岛素治疗的辅助药物。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为:竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。
[0004]α -葡萄糖苷酶抑制剂的筛选方法常用有两大类。第一类是葡萄糖氧化法，即以蔗糖或麦芽糖为底物，通过葡萄糖的生成量测定α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性。例如，张冉等人在《应用α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型筛选降血糖中药》(张冉等，中国药学杂志，2007 (10))中公开一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选方法:应用大鼠小肠上段提取的α-葡萄糖苷酶，以蔗糖作为底物，通过测定反应体系中葡萄糖的生成量来检测α-葡萄糖苷酶的活性；通过优化酶促反应条件，建立检测α-葡萄糖苷酶活性的比色测定法及其抑制剂体外筛选的方法，并对30味中药共72个样品进行高通量筛选。然而，绝大多数人群食物中碳水化合物的主要形式是淀粉，并非蔗糖或麦芽糖。
[0005]第二类是PNPG法，即以4-硝基苯基-a -D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，在波长400nm (或405nm)处测定在酶作用下释放出的有颜色的物质硝基酚(PNP)的量测定抑制剂的抑制活性。例如，专利CN101975829A公开了一种α -葡萄糖苷酶抑制剂的筛选方法，分三步:(I)体外筛选模型的建立:建立α -葡萄糖苷酶和底物PNPG的体外反应模型；(2)组分库的建立:选取中药，根据“相似相容”原理，按照极性由小到大，用多种O 2种)溶剂对每味中药进行系统提取，采用这种方法，每味中药获得多个提取部位；(3)筛选:将中药的各个提取部位配成一定浓度的溶液，加入到反应模型中反应并计算抑制率。该筛选方法简单合理，易于操作，最终筛选出对α-葡萄糖苷酶有显著抑制效果的中药和中药组分。但是，用PNPG来代替人体从食物中获得的糖类，并据此来筛选抑制剂，得到的结论值得商榷，因为PNPG根本不存于与人体的肠道环境。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种α -葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型，以马铃薯淀粉为底物，α -葡萄糖苷酶与马铃薯淀粉底物的水解产物葡萄糖采用3，5- 二硝基水杨酸法测定其标准曲线；其技术操作简单，成本相对低廉，筛选抑制剂的灵敏度更高。
[0007]本发明的另一个目的在于提供一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选方法，其技术操作简单，成本相对低廉，筛选抑制剂的灵敏度更高。该方法所选底物更接近食物，抑制剂的筛选结果更具说服力。
[0008]本发明的再一个目的在于提供一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选方法在天然产物提取物或中药复方提取物中的应用。
[0009]本发明提供一种α -葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型，包括
[0010]Α.建立α -葡萄糖苷酶和马铃薯淀粉底物的体外反应模型；
[0011]B.制作水解产物葡糖糖的标准曲线；
[0012]C.α -葡萄糖苷酶活性抑制率的测定。
[0013]马铃薯淀粉更接近人体从食物中获得的糖类，采用其筛选α-葡萄糖苷酶活性抑制剂，筛选结果更具说服力。同时，马铃薯淀粉中不含有还原糖残基，相比可溶性淀粉(含有微量的还原糖残基)作为底物，其反应结果更为准确、灵敏。
[0014]较佳的，所述的α-葡萄糖苷酶为提取自根霉的III型α-葡萄糖苷酶，相比于提取自酵母的I型α-葡萄糖苷酶更为经济。
[0015]较佳的，采用3，5- 二硝基水杨酸法制作水解产物葡糖糖的标准曲线:在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光值(0D值)，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。
[0016]较佳的，α -葡萄糖苷酶活性抑制率的计算公式为:
[0017]
【权利要求】
1.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型，包括 Α.建立α-葡萄糖苷酶和马铃薯淀粉底物的体外反应模型； B.制作水解产物葡糖糖的标准曲线； C.α-葡萄糖苷酶活性抑制率的测定。
2.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型，其特征在于:所述的α -葡萄糖苷酶为提取自根霉的III型α -葡萄糖苷酶。
3.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型，其特征在于:采用3，5- 二硝基水杨酸法制作水解产物葡糖糖的标准曲线。
4.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型，其特征在于:α-葡萄糖苷酶活性抑制率的计算公式为:酶活性抑制
5.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型，其特征在于:还包括D.筛选模型的有效性验证。
6.根据权利要求5所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型，其特征在于:筛选模型的有效性采用阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制曲线进行验证。
7.—种α-葡萄糖苷酶抑制 剂的筛选方法，其特征在于:包括 步骤1:建立根据权利要求1至6中任一项所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型；步骤2:将天然产物提取物或中药提取物加入到步骤I的筛选模型中反应并计算酶活性抑制率，筛选出酶活性抑制率较大的组分。
8.一种根据权利要求7所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选方法在天然产物提取物或中药提取物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述的天然产物提取物为黄连地黄提取物、刺五加叶提取物、银杏叶提取物、黄芩提取物中的一种或者任意组合。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述的中药提取物为下列中的一种或其任意组合:地榆、肉桂、鸡血藤、丁香、榧子、金荞麦、西青果、石榴皮、赤芍、锁阳的水提取物；中药榧子、金荞麦、五倍子、地榆、西青果、石榴皮、鸡血藤、肉桂、大黄、鬼箭羽的甲醇提取物；中药五倍子、肉桂、大黄、知母、鸡血藤、桑枝、赤芍、金石斛、山药、锁阳的乙酸乙酯提取物；中药大黄、五倍子、甘草、茯苓、牛膝、知母、鸡血藤、地骨皮、黄精、五爪龙的二氯甲烷提取物；中药五倍子、牛膝、牛蒡子、茯苓、甘草、大黄、黄精、夏枯球、金荞麦、玉竹的正己烷提取物。
【文档编号】G01N21/31GK103868867SQ201410098701
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】严伟, 刘春滟 申请人:四川师范大学