一种同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法
【专利摘要】本发明涉及一种同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，所述检测方法包括以下步骤：①采取人体血浆，并将血浆用甲醇进行脱蛋白，得到含有多种氨基酸的上清液；②将所得到的含有多种氨基酸的上清液与衍生化试剂进行衍生化反应，生成有紫外吸收的衍生化产物；③对衍生化产物采用高效液相法进行分析。该检测方法操作简单，可同时检测出人体血液中所含的多种氨基酸，具有高准确度和高灵敏度。
【专利说明】一种同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学分析检测领域，尤其是一种操作简单、检测成本低、具有高度准确性和高度灵敏的检测方法，具体涉及一种同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法。
【背景技术】
[0002]氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。它在抗体内具有特殊的生理功能，是生物体内不可缺少的营养成分之一。构成人体的最基本的物质，有蛋白质、脂类、碳水化合物、无机盐、维生素、水和食物纤维等。作为构成蛋白质分子的基本单位的氨基酸，无疑是构成人体最基本物质之一。
[0003]蛋白质在机体内的消化和吸收式通过氨基酸来完成的:作为机体内第一营养要素的蛋白质，它在食物营养中的作用是显而易见的，它在人体内并不能直接被利用，而是通过变成氨基酸小分子被利用。
[0004]生命的产生、存在和消亡，无一不与蛋白质有关，正如恩格斯所说:“蛋白质是生命的物质基础，生命是蛋白质存在的一种形式。”如果人体内缺少蛋白质，轻者体质下降，发育迟缓，抵抗力减弱，贫血乏力，重者形成水肿，甚至危及生命。一旦失去了蛋白质，生命也就不复存在，故有人称蛋白质为“生命的载体”。可以说，它是生命的第一要素。
[0005]蛋白质的基本单位是氨基酸。如果人体缺乏任何一种必需氨基酸，就可导致生理功能异常，影响机体代谢的正常进行，最后导致疾病。同样，如果人体内缺乏某些非必需氨基酸，会产生机体代谢障碍。精氨酸和瓜氨酸对形成尿素十分重要；胱氨酸摄入不足就会引起胰岛素减少，血糖升高。又如创伤后胱氨酸和精氨酸的需要量大增，如缺乏，即使热能充足仍不能顺利合成蛋白质。总之，氨基酸在人体内通过代谢可以发挥下列一些作用:①合成组织蛋白质变成酸、激素、抗体、肌酸等含氨物质；③转变为碳水化合物和脂肪；④氧化成二氧化碳和水及尿素，产生能量。因此，氨基酸在人体中的存在，不仅提供了合成蛋白质的重要原料，而且对于促进生长，进行正常代谢、维持生命提供了物质基础。如果人体缺乏或减少其中某一种，人体的正常生命代谢就会受到障碍，甚至导致各种疾病的发生或生命活动终止。由此可见，氨基酸在人体生命活动中显得多么需要。
[0006]目前国内外使用的检测方法有电化学法、分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法及气相色谱法等。高效液相色谱法是目前使用最为普遍的方法，而高效液相色谱法中的离子交换法和反相色谱法又是应用最广泛的两种。但目前的方法大多比较操作复杂。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，该检测方法操作简单，可同时检测人体血浆中可能出现的24种氨基酸中的任意一种或几种或全部，具有高准确度和高灵敏度。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案来实现:[0009]一种同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，所述多种氨基酸分别为:天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、瓜氨酸、牛磺酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、氯化铵、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鸟氨酸以及赖氨酸中的一种或几种或全部；所述方法包括以下步骤:①采取人体血浆，并将血浆用甲醇进行脱蛋白，得到含有多种氨基酸的上清液；②将所得到的含有多种氨基酸的上清液与衍生化试剂进行衍生化反应，生成有紫外吸收的衍生化产物；③对衍生化产物采用高效液相法进行分析。
[0010]进一步地，步骤①中脱蛋白的具体过程为:取人体血浆样品置于离心管中，加入甲醇，震荡混匀，再用12000r/m的转速离心5min，并取上清液置于干净的离心管中，该上清液即为步骤①所述的含有多种氨基酸的上清液。
[0011]进一步地，步骤②中衍生化反应的具体过程为:向所述的含有多种氨基酸的上清液中加入三乙胺溶液、异硫氰酸苯酯溶液和内标溶液，均匀混合，室温下衍生lh，加入正己烷，漩涡混匀，静置lOmin，取下层溶液过0.2μπι的滤膜，进样分析，以色谱峰面积内标法定量。
[0012]进一步地，所述三乙胺溶液为三乙胺乙腈溶液，所述异硫氰酸苯酯溶液为异硫氰酸苯酯乙腈溶液,所述内标溶液为用0.lmol/L盐酸将内标物溶解并稀释为50ymol/L的内标溶液。
[0013]进一步地，所述内标物为正亮氨酸(Nle)。
[0014]进一步地，所述人体血浆样品与所加甲醇的体积比为:1: 3。
[0015]进一步地，所述含有多种氨基酸的上清液、三乙胺乙腈溶液、异硫氰酸苯酯乙腈溶液以及内标溶液的体积比为:2:1:1:1。
[0016]进一步地，在用高效液相法进行分析中，所用流动相包括流动相A和流动相B ;流速 0.8mL/min ;检测波长:254nm。
[0017]进一步地，所述流动相A为0.05%醋酸钠溶液，所述醋酸钠溶液是在醋酸钠中加水，并用冰醋酸调PH至6.35，摇匀后用0.45 μ m的滤膜过滤，超声脱气10min_15min。
[0018]进一步地,所述流动相B为分析纯的乙腈。
[0019]本发明提供了一种同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，其主要具有的有益效果为:本发明所述的方法能够同时检测出血液中可能存在的24种氨基酸中的任何一种或几种或全部，此方法操作简单、具有高准确度和高灵敏度，在临床上具有重要的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]下面根据附图对本发明作进一步详细说明。
[0021]图1是本发明实施例所述的以0.lmol/L的盐酸溶液作为阴性对照所得的高效液相色谱图；
[0022]图2是本发明实施例所述的含24种氨基酸的标准溶液的高效液相色谱图；
[0023]图3是本发明实施例所述的正常人体血浆液中24种氨基酸的高效液相色谱图；
[0024]图4是本发明实施例所述的苯丙氨酸异常者血浆中24种氨基酸的高效液相色谱图；[0025]在图1~4中:1、天冬氨酸(asp) ;2、谷氨酸(glu) ;3、天冬酰胺(asn) ;4、丝氨酸(ser) ;5、谷氨酰胺(Gln) ;6、甘氨酸(gly) ;7、组氨酸(his) ;8、瓜氨酸(cit) ;9、牛磺酸(tau) ;10、精氨酸(arg) ;11、苏氨酸(thr) ;12、丙氨酸(ala) ;13、脯氨酸(pro) ;14、氯化铵(NH4C1) ;15、酪氨酸(tyr) ;16、缴氨酸(val) ;17、蛋氨酸(met) ;18、半胱氨酸(cys) ;19、异亮氨酸(ile) ;20、亮氨酸(Ieu) ;21、苯丙氨酸(phe) ;22、色氨酸(trp) ;23、鸟氨酸(orn)；24、赖氨酸(Iys) ο
【具体实施方式】
[0026]如图1-4所示，本发明所述的所有24种氨基酸均指下述24种，且其分别对应附图标记为:1、天冬氨酸(asp) ;2、谷氨酸(glu) ;3、天冬酰胺(asn) ;4、丝氨酸(ser) ;5、谷氨酰胺(Gln) ;6、甘氨酸(gly) ;7、组氨酸(his) ;8、瓜氨酸(cit) ;9、牛磺酸(tau) ;10、精氨酸(arg) ;11、苏氨酸(thr) ;12、丙氨酸(ala) ;13、脯氨酸(pro) ;14、氯化铵(NH4C1) ;15、酪氨酸(tyr) ;16、缬氨酸(val) ;17、蛋氨酸(met) ;18、半胱氨酸(cys) ;19、异亮氨酸(ile)；20、亮氨酸(Ieu) ;21、正亮氨酸(Nle，为内标，不属于本发明所述的24种氨基酸)；22、苯丙氨酸(phe) ;23、色氨酸(trp) ;24、鸟氨酸(orn) ;25、赖氨酸(Iys)。[0027]本发明所述的同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法具体包括以下步骤:①采取人体血浆，并将血浆用甲醇进行脱蛋白，即取人体血浆200 μ L的样品置于1.5mL的离心管中，加入600 μ L的甲醇，震荡混匀，再用12000r/m的转速离心5min 取步骤a中所得上清取200 μ L置于另一离心管中，再加入三乙胺乙腈溶液、异硫氰酸苯酯乙腈溶液和内标各100 μ L，混匀3min，室温下衍生Ih ;加入正己烷400 μ L，漩涡混匀，静置lOmin，取下层溶液(即为所得的衍生化产物)；③对衍生化产物采用高效液相法进行进样分析，以色谱峰面积内标法定量，其中，流动相包括流动相A和流动相B，流速0.8mL/min ;检测波长:254nm ；所述流动相A是0.05%醋酸钠溶液，用醋酸调PH至6.35，摇匀后用0.45 μ m的滤膜过滤，超声脱气10min-15min ;所述流动相B是分析纯的乙腈。流动相A和流动相B的体积百分比与时间的对应关系可参见下表。
[0028]
【权利要求】
1.一种同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，其特征在于:所述多种氨基酸分别为:天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、瓜氨酸、牛磺酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、氯化铵、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鸟氨酸以及赖氨酸中的一种或几种；所述方法包括以下步骤: ①采取人体血浆，并将血浆用甲醇进行脱蛋白，得到含有多种氨基酸的上清液； ②将所得到的含有多种氨基酸的上清液与衍生化试剂进行衍生化反应，生成有紫外吸收的衍生化产物； ③对衍生化产物采用高效液相法进行分析。
2.根据权利要求1所述的同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，其特征在于:步骤①中脱蛋白的具体过程为:取人体血浆样品置于离心管中，加入甲醇，震荡混匀，再用12000r/m的转速离心5min，并取上清液置于干净的离心管中，该上清液即为步骤①所述的含有多种氨基酸的上清液。
3.根据权利要求1或2所述的同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，其特征在于:步骤②中衍生化反应的具体过程为:向所述的含有多种氨基酸的上清液中加入三乙胺溶液、异硫氰酸苯酯溶液和内标溶液，均匀混合，室温下衍生lh，加入正己烷，漩涡混匀，静置lOmin，取下层溶液过0.2 μ m的滤膜，进样分析，以色谱峰面积内标法定量。
4.根据权利要求3所述的同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，其特征在于:所述三乙胺溶液为三乙胺乙腈溶液，所述异硫氰酸苯酯溶液为异硫氰酸苯酯乙腈溶液，所述内标溶液为用0.lmol/L盐酸将内标物溶解并稀释为50ymol/L的内标溶液。
5.根据权利要求4所述的同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，其特征在于:所述内标物为正亮氨酸。
6.根据权利要求2所述的同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，其特征在于:所述人体血浆样品与所加甲醇的体积比为:1: 3。
7.根据权利要求4所述的同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，其特征在于:所述含有多种氨基酸的上清液、三乙胺乙腈溶液、异硫氰酸苯酯乙腈溶液以及内标溶液的体积比为:2:1:1:1。
8.根据权利要求1所述的同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，其特征在于:在用高效液相法进行分析中，所用流动相包括流动相A和流动相B ;流速0.8mL/min ;检测波长:254nm。
9.根据权利要求8所述的同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，其特征在于:所述流动相A为0.05%醋酸钠溶液，所述醋酸钠溶液是在醋酸钠中加水，并用冰醋酸调PH至6.35,摇勻后用0.45 μ m的滤膜过滤,超声脱气10min_15min。
10.根据权利要求8所述的同时检测人体血浆中多种氨基酸含量的方法，其特征在于:所述流动相B为分析纯的乙腈。
【文档编号】G01N30/02GK103837620SQ201410105963
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】徐立旭 申请人:上海硕源健标生物医学科技有限公司