脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法
【专利摘要】本发明公开一种脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法，其中，将酶活检测体系在235nm波长处在指定时间T内测定其光程长PL和透光率Vmax；根据公式A=Vmax/T/PL/Conc./V计算出脂肪氧化酶酶活性，其中，A表示脂肪氧化酶酶活性，Conc.表示所测定的脂肪氧化酶酶产品溶液的稀释倍数，V表示加入到所述酶活检测体系中的所述脂肪氧化酶酶产品溶液的体积；所述酶活检测体系包含pH9.0的硼酸缓冲液、亚油酸溶液以及含脂肪氧化酶的酶产品溶液。本发明脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法操作简便、灵敏度高、不易受干扰的、结果精确，适合在生产实际中应用。
【专利说明】脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶学检测【技术领域】，尤其涉及一种脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法。
【背景技术】
[0002]在制备食品的小麦面粉中，由于小麦产地和品种不同等因素，造成小麦面粉的品质差异很大，通常需要加入面粉改良剂来增强面团的弹性和韧性，并且改良面团的流变学特性，以使制得的面制食品纹理均匀、规整、平滑、色泽洁白、富于弹性且口感细腻。
[0003]传统的面粉改良剂，是以化学添加剂为主。随着人们生活水平的日益提高，食品安全以及健康饮食越来越受到重视。因此，对食品原材料和添加剂的要求和监控越来越严格。使用安全的生物酶制剂替代传统的化学制剂已经成为了食品行业的一大趋势。为了迎合这一行业趋势，并和国际水平同步，研发了脂肪氧化酶系列产品。此系列产品可以良好地增大面团体积，并对面团有一定的漂白功能，受到了用户的广泛期待。
[0004]生物酶产品的重要质量指标之一，是酶产品的酶活性。准确的定量测量酶产品活性的大小，对生物酶的生产和销售都用重要意义。
[0005]《无锡轻工大学学报》(2001.01-0077-04)报道了三种测定脂肪氧化酶的方法，分别为量压法，分光光度法和KI2淀粉法。
[0006]1.量压法
[0007]由于脂肪氧化酶的作用，底物亚油酸可以与氧结合，形成过氧化物。量压法正是利用这一原理，通过测定密闭体系内的氧气量减少，间接测定脂肪氧化酶产品的活性。
[0008]这种测定方法，对脂肪氧化酶样品的粗拙程度没有要求，适合较为初级的样品测定，但操作步骤较为复杂，不能适应连续的样品测定的要求，而且由于测量时需要不断震动，可能影响酶活力，对微量的酶活性监测不够准确，灵敏度差。
[0009]2.分光光度法
[0010]脂肪氧化酶催化底物亚油酸的过程中，会产生具有共轭二烯键的中间体。共轭二烯键的一个特点是可以吸收234nm光波。因此通过测定234nm光波，可以间接推算酶活力。分光光度法就是根据这一原理，测定共轭二烯键的浓度，从而测定酶活性的大小。
[0011]这种方法的优势是可以连续多样品测定，但对仪器要求较高，且由于是测定紫外光波，因此对样品中的杂质较为敏感，因此只适合于较为纯净的酶样品测定，不适合应用于实际生产中较粗样品的测定。且由于是直接测定的中间体，具有不稳定性，因此随时间变化，分光光度值也在不断变化。因为灵敏度低，不适合酶活性较低的样品。
[0012]3.KI2 淀粉法
[0013]脂肪氧化酶催化亚油酸形成过氧化物，过氧化物可以将碘离子氧化还原为碘，而碘可以与淀粉结合并显色。根据这一原理，可以间接测定脂肪氧化酶活性，既为KI2法。
[0014]与分光光度法相似，这种方法受到杂质和时间影响较大。而且由于在酸性条件下显色，酶样品中的蛋白质和脂肪等杂质也可能在酸性条件下絮凝，影响观测和结果的可靠性。因此这种方法也无法适应生产条件下复杂的酶样品条件。
[0015]上述三种方法各有局限性，不能满足实际生产中的快速准确的测定需要，大大限制了它们的应用。
【发明内容】
[0016]本发明的目的是，为克服现有技术的不足，提供一种操作简便、灵敏度高、不易受干扰的、结果精确的适合在轻工食品工业生产过程中实现对面粉烘培酶——脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法。
[0017]I单位脂肪氧化酶活力的定义为:在25°C下，pH9.0环境中，脂肪氧化酶在3.0ml亚油酸溶液中以Icm光照距离，光度值在234nm光波上每分钟改变0.001所需的酶活力。
[0018]为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下:
[0019]一种脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法，其中，将酶活检测体系在235nm波长处在指定时间T内测定其光程长PL和透光率Vmax ;根据公式A=Vmax/T/PL/C0nc./V计算出脂肪氧化酶酶活性，其中，A表示脂肪氧化酶酶活性，Conc.表示所测定的脂肪氧化酶酶产品溶液的稀释倍数，V表示加入到所述酶活检测体系中的所述脂肪氧化酶酶产品溶液的体积；所述酶活检测体系包含PH9.0的硼酸缓冲液、亚油酸溶液以及含脂肪氧化酶的酶产品溶液。
[0020]关于试剂的浓度:所述硼酸缓冲液的浓度为0.1M。所述亚油酸溶液的浓度为25mM。
[0021]其中，所述亚油酸溶液为亚麻酸和水的乳化液。具体地，所述乳化液通过适量的亚麻酸与一定量的水充分搅拌成乳状液得到。
[0022]关于酶产品溶液:所述酶产品溶液为溶解在酶样品缓冲液中的脂肪氧化酶提取物，所述酶样品缓冲液包含7.88g/l的三羟甲基氨基甲烷、8.766g/l的氯化钠和100g/l的甘油。
[0023]进一步地，所述酶活检测体系中所述硼酸缓冲液、亚油酸溶液和酶产品溶液的混合体积比为89:1 =IO0
[0024]优选地，使用96孔板作为所述酶活检测体系的反应容器。
[0025]关于测量方法:所述测量的指定时间T为lOmin，每30s测量一次。
[0026]与现有技术相比较，本发明具有如下优势:
[0027]a)本发明所提供的检测方法，根据脂肪氧化酶的酶动力学特性，确立了反应终产物的透光率和反应时间的线性关系，并据此对脂肪氧化酶酶活性进行定量计算；该方法对比现有技术，测量更可靠，方法更精确。
[0028]b)本发明所提供的检测方法，根据上述的脂肪氧化酶酶学特性，推导出了脂肪氧化酶活性的定量计算公式，使用这一公式，可以得到酶活力的标准化结果；并且，公式中的变量均使用国际单位，可以与现有技术得出的结果作横向比较。
[0029]本发明所提供的检测方法，应用96孔板以及孔板检测仪对脂肪氧化酶活性进行量化测定，可以一次性对多个样品进行测量，大大提高了监测效率。
【专利附图】
【附图说明】[0030]图1为采用本发明脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法测定大豆脂肪氧化酶提取液的酶动力学变化结果图。
[0031]图2为ClO样品孔中的大豆脂肪氧化酶提取液的酶动力学变化结果图。
[0032]图3为A?GlO和A?G12样品孔中大豆脂肪氧化酶提取液的检测结果和酶活计
晳奸里
【具体实施方式】
[0033]以下结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述。
[0034]检测大豆脂肪氧化酶的提取液中脂肪氧化酶的酶活性，步骤如下:
[0035]( I)酶活检测体系的准备
[0036]I)配制0.1M ρΗ9.0的硼酸缓冲液:将38g四硼酸钠溶于IL的水中，得到0.1M的硼酸钠溶液；将6.2g硼酸溶于IL的水中，得到0.1M的硼酸溶液。将所述硼酸钠溶液与硼酸溶液混合，将PH调整至9.0，得到0.1M的硼酸缓冲液。
[0037]2)配制25mM亚油酸溶液:将155 μ I (140mg)亚麻酸溶解到5ml水溶液中，充分搅拌使得溶液完全乳化成乳状液，用20ml的容量瓶加水定容至20ml ;将配好的所述溶液分成Iml小份，在_20°C保存。
[0038]3)配制酶产品溶液:
[0039]a.酶样品缓冲液的配制:将7.88g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、8.766g氯化钠(NaCl)和IOOg甘油(glycerol)溶解在水中，然后用IL的容量瓶加水定容至1L。
[0040]b.大豆脂肪氧化酶提取液的制备:
[0041]-将大豆浸泡过夜。
[0042]-将泡过的大豆用手持破碎机(KitchenAid双速手持破碎机)打碎，并使用8英尺不锈钢滤网(Good Cook滤网)进行过滤，滤液补充所述酶样品缓冲液至大豆干重的5倍，得粗提液。
[0043]-将所述粗提液用离心机(HeckmanJ2-HS)在10，500g离心力下离心20min,取上清液，得到大豆脂肪氧化酶提取液。
[0044](2)仪器参数的设定
[0045]使用Molecular Devices, SpectraMaxl90UV孔板测量仪,测量数据设定如下:
[0046]波长:235nm，
[0047]温度:室温，
[0048]光程长(pathlength):开启检查，
[0049]测量方式:每30s测量一次,测量IOmin (T),
[0050]最大OD 值:3.0
[0051](3)检测步骤
[0052]I)将所述大豆脂肪氧化酶提取液分别稀释2、4、8、16、32、64、128倍(Cone.)，分别放入96孔板A?G行的样品孔中，每孔20 μ I (V)；
[0053]2)在96孔板的H行加入20 μ I /K，作为空白对照；
[0054]3)预留96孔板的第12列作为不加酶产品溶液的空白对照；
[0055]4)每个样品孔再加入2 μ I亚油酸溶液和178 μ I硼酸缓冲液；[0056]5)迅速将载有所述酶活检测体系的96孔板放入所述UV孔板测量仪中，开始测量，记录光程长(PL)和透光率(Vmax)。
[0057](4)检测结果与计算
[0058]图1显示了不同稀释浓度的所述大豆脂肪氧化酶提取液的酶动力学变化结果，图中每个方格与96孔板中编号相同的样品孔相对应，方格内的曲线为指定时间T内该样品孔中的酶活检测体系的透光率的连续的变化曲线，曲线下的数字为所在曲线的拟合直线的斜率。图中 A10、B10、C10、D10、E10、F10、G10 分别为含有稀释了 2、4、8、16、32、64、128 倍的大豆脂肪氧化酶提取液，H10、A12、B12、C12、D12、E12、F12、G12、H12均为空白对照。
[0059]根据本发明的检测原理，需要选取透光率和反应时间线性关系最好的一组作为计算基准，即需要选取变化曲线与其自身拟合直线最接近的一组。如图2所示，本实施例中ClO为线性关系最佳的一组，下面以ClO的数据(参考图3)为基准计算本实施例中大豆脂肪氧化酶提取液的酶活性:
[0060]脂肪氧化酶酶活性A=Vmax/T/PL/Conc./V，其中 Vmax/T/PL=520.668 (mAu/min),Cone.=0.125, V=0.02 (ml )，因此 Α=208267.0 (mAu/min/ml )。
[0061]综上所述，本发明脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法操作简便、灵敏度高、不易受干扰的、结果精确，适合在生产实际中应用。
[0062]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法，其特征在于:将酶活检测体系在235nm波长处在指定时间T内测定其光程长PL和透光率Vmax ； 根据公式A=Vmax/T/PL/C0nc./V计算出脂肪氧化酶酶活性，其中，A表示脂肪氧化酶酶活性，Conc.表示所测定的脂肪氧化酶酶产品溶液的稀释倍数，V表示加入到所述酶活检测体系中的所述脂肪氧化酶酶产品溶液的体积； 所述酶活检测体系包含PH9.0的硼酸缓冲液、亚油酸溶液以及含脂肪氧化酶的酶产品溶液。
2.如权利要求1所述的脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法，其特征在于:所述硼酸缓冲液的浓度为0.1M。
3.如权利要求1所述的脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法，其特征在于:所述亚油酸溶液的浓度为25mM。
4.如权利要求3所述的脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法，其特征在于:所述亚油酸溶液为亚麻酸和水的乳化液。
5.如权利要求4所述的脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法，其特征在于:所述乳化液通过适量的亚麻酸与一定量的水充分搅拌成乳状液得到。
6.如权利要求1所述的脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法，其特征在于:所述酶产品溶液为溶解在酶样品缓冲液中的脂肪氧化酶提取物，所述酶样品缓冲液包含7.88g/l的三羟甲基氨基甲烷、8.766g/l的氯化钠和100g/l的甘油。
7.如权利要求2?6任意一项所述的脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法，其特征在于:所述酶活检测体系中所述硼酸缓冲液、亚油酸溶液和酶产品溶液的混合体积比为89:1:10o
8.如权利要求7所述的脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法，其特征在于:使用96孔板作为所述酶活检测体系的反应容器。
9.如权利要求8所述的脂肪氧化酶酶活性的准确定量检测方法，其特征在于:所述测量的指定时间T为lOmin，每30s测量一次。
【文档编号】G01N21/77GK103913450SQ201410107936
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】刘高峰 申请人:中山市南方新元食品生物工程有限公司