强抗基质干扰型双酚a上转换荧光层析试纸条及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条及制备方法。该试纸条包括在衬板上依次衔接的样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫，其中，结合垫吸附有主要由上转换荧光纳米材料与双酚A抗体形成的上转化荧光-双酚A抗体复合物探针，而包被膜上分布有检测标记和对照标记，检测标记内含双酚A包被抗原。其制备方法包括：结合垫的制备、包被膜的制备以及样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫与衬板的组装等。本发明的试纸条激发波长处于能量较低的近红外区域，可以有效避免生物样品的自体荧光的干扰，使得检测的背景荧光降低，信噪比提高，具有很高灵敏度和特异性，且其制备方法简单，成本低廉，在使用时还具有简便、快速、准确等优点。
【专利说明】强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明特别涉及一种强抗基质干扰型快速检测双酚A的上转换荧光层析试纸条及制备方法，属于荧光免疫方法检测技术及食品安全快速检测领域。
【背景技术】
[0002]在近几年的研究中发现BPA (Bisphenol A，2，2_ 二(4_羟基苯基)丙烷)是一种“破坏内分泌系统的化学物质”(Endocrine Disrupting Chemicals, EDCs),具有某些雌激素的特性，对雄性生殖系统有一定的损害作用，对胚胎也有一定影响，能加速性早熟，或造成孩童多动及注意力散漫等精神障碍。BPA在低剂量时就具有DNA氧化损伤作用而且能诱导染色体异常，并能影响宿主的非特异性免疫防御系统。因此BPA的危害引起了各国对食品及包装材料的广泛关注，已相继有从蔬菜罐头、婴儿用调制液、食品罐等检出BPA的报道。食品包装材料中的BPA残留越来越引起国内外重视，因此各种检测BPA的方法也开始发展起来。现有的仪器检测法虽然有灵敏度高、适用范围广等优点，但是样品前处理复杂，所需的仪器价格昂贵，检测成本高，检测时间长，而且只有特定的专业技术人员才能操作，不能进行现场、快速检测，时效性差，难以推广，很难实现对BPA进行快速、现场的检测。此夕卜，传统的基于有机染料或者突光量子点的突光试纸条及胶体金试纸条在一定条件下虽然可以实现快速检测BPA，但在复杂的生物样品中(血液，尿液及唾液)含有复杂的生物样品，而染料以及荧光量子点的激发光源同时可以激发检测溶液中的生物样品的自体荧光以及侧向层析试纸条中硝酸纤维膜的背景荧光，从而对BPA的实际检测结果造成影响，降低了检测的灵敏度和准确性。同样胶体金试纸条也具有灵敏度低、检测范围窄等缺点。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条及制备方法，从而实现对食品包装材料中双酚A含量的更加快速、灵敏、简便地检测。
[0004]为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案:
一种强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条，包括在衬板上依次衔接的样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫，其中，所述结合垫吸附有主要由能在波长为980 nm的光源激发下发出短波长可见光区域发射光的上转换荧光纳米材料与双酚A抗体形成的上转化荧光-双酹A抗体复合物,所述包被膜上分布有检测标记,所述检测标记内包含双酹A包被抗原。
[0005]作为较为优选的实施方案之一，所述包被膜上还分布有对照标记，所述对照标记与检测标记间隔设置，并且所述对照标记内包含羊抗兔或羊抗鼠IgG。
[0006]作为较为优选的实施方案之一，所述检测标记包括以双酚A包被抗原溶液在包被膜上印制的检测线，所述对照标记包括以羊抗兔或羊抗鼠IgG抗体溶液在包被膜上印制的对照线，所述检测线与对照线平行分布。[0007]作为较为优选的实施方案之一，所述试纸条可包括依次衔接的第一样品垫、结合垫、第二样品垫和吸水垫，其中，第二样品垫上覆设有包被膜。
[0008]一种强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析检测试纸条的制备方法，包括:
提供能在波长为980nm的光源激发下发出短波长发射光的上转换荧光纳米材料和双酚A抗体，并将所述上转换荧光纳米材料与双酚A抗体偶联，获得上转化荧光-双酚A抗体复合物，而后将所述上转化荧光-双酚A抗体复合物吸附于结合垫上；
提供包被膜，并至少在所述包被膜上设置检测标记，且所述检测标记内包含双酚A包被抗原；以及
提供样品垫和吸水垫，并将样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫依次衔接且附着在衬板上，获得目标广品。
[0009]作为较为优选的实施方案之一，该方法还包括:
分别以双酚A包被抗原溶液和羊抗兔或羊抗鼠IgG抗体溶液在包被膜上分别印制形成检测标记和对照标记，所述检测标记和对照标记包括平行分布的检测线与对照线。
[0010]作为较为优选的实施方案之一，该方法具体包括如下步骤:
(1)提供上转换荧光纳米材料，并在上转换荧光纳米材料修饰用以与双酚A抗体偶联的活性基团，而后将双酚A抗体与上转换荧光纳米材料偶联，获得上转化荧光-双酚A抗体复合物，而后将上转化荧光-双酚A抗体复合物施加至结合垫上；
(2)以双酚A包被抗原溶液和羊抗兔IgG抗体溶液分别在包被膜上印制形成平行分布的检测线与对照线；
(3)将样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫依次衔接且附着在衬板上，获得目标产品。
[0011]作为较为优选的实施方案之一，该方法还包括:
将疏水性的上转化荧光纳米材料氧化形成亲水性的上转化荧光纳米材料，而后将上转化荧光纳米材料上的羧基活化，使之与双酚A抗体上的氨基结合形成肽键，从而实现上转化荧光纳米材料与双酚A抗体的偶联。
[0012]前述样品垫和/或结合垫的材料可选自但不限于玻璃纤维棉。
[0013]所述衬板的材料主要由不吸水的韧性材料形成，所述韧性材料可选自但不限于硬质塑胶条。
[0014]所述包被膜可选自但不限于硝酸纤维素膜。
[0015]所述吸水垫可选自但不限于吸水滤纸。
[0016]作为较为优选的实施方案之一,所述上转化突光-双酹A抗体复合物包括上转换荧光标记的双酚A多克隆抗体。
[0017]作为较为优选的实施方案之一，所述包被抗原包括双酚酸与载体蛋白人血清白蛋白的耦联物。
[0018]本发明系采用竞争识别法，即样品中的双酚A和固定在包被膜上的BPA包被抗原竞争识别上转换荧光纳米材料标记的抗双酚A多克隆抗体或单克隆抗体。
[0019]进一步讲，本发明的试纸条在工作时，将样品垫加入待检测样品后，样品溶液沿着试纸条通过液体毛细作用从下往上迁移，结合垫上干燥的上转换荧光纳米材料标记的BPA抗体就会被溶解而随之迁移。若待测样品中不存在BPA，则上转换荧光纳米材料标记抗体会迁移到检测线上，并与包被膜上的BPA包被原发生免疫识别反应，从而上转化荧光颗粒就会固定在检测线上，形成有荧光的线条，而其他未结合的上转化荧光纳米粒子标记的抗体则会继续通过毛细作用向前迁移，与控制线上的羊抗兔或羊抗鼠二抗发生第二次免疫反应并固定在控制线，同样形成有荧光的线条，这时包被膜上就会有两条荧光线条，表示样品为阴性。若待测样品中存在待测物双酚A，则上转化荧光纳米粒子标记的抗体首先会和样品中的检测物双酚A发生免疫识别反应，当上转化荧光纳米粒子标记的抗体有剩余，才会在检测线上与BPA包被原发生免疫识别反应，形成荧光线条，但所形成的荧光条带的强度会弱于阴性时检测线的荧光强度；而当上转化荧光纳米粒子标记抗体全部和检测样品中的双酚A发生免疫结合时，就不会再有上转换荧光纳米材料标记的抗体与检测线上BPA包被原结合，从而检测线就不会有荧光线条出现。但通过免疫识别结合了 BPA的上转换荧光纳米材料标记的抗体在毛细作用下进一步迁移至控制线并与控制线上的羊抗兔或羊抗鼠二抗结合，从而使控制线上显现荧光。控制线是为检验上转换荧光标记免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在待测物双酚A，控制线都应该显现。如果控制线不显荧光，则说明所建立的试纸条检测结果无效。
[0020]需要注意的是，本发明所建立的基于上转换荧光纳米材料标记的强抗基质干扰型双酚A快速侧向层析试纸条检测方法是在激发波长为980nm的激光激发下进行检测结果观察的，在该波长的激光激发条件下，复杂检测样品中的其他生物分子以及包被膜(如，硝酸纤维膜)的背景荧光都不能够被激发，因此大大降低了检测结果中背景荧光的干扰，提高了检测方法的灵敏度。
[0021]与现有技术相比，本发明至少具有下列优点:
①本发明的试纸条在980nm的激光激发下即可分辨是否含有目标物，且样品滴加到样品垫上只需很短的时间就可以检测到结果。
[0022]②本发明的试纸条在使用时，是利用在980nm激光光源下得到的光源来定量检测的，而在检测样品中的生物分子和检测试纸条上硝酸纤维膜的背景荧光均不会被激发，因此能有效降低检测过程中背景荧光对检测结果的干扰，提高性噪比，从而进一步提高检测的灵敏度。
[0023]③本发明的试纸条以在上转换荧光纳米材料上标记对BPA具有高亲和力的抗体来捕获目标物BPA为基础而设计，因此具有很高的特异性。并且因背景荧光的降低使得在很低的目标物下浓度下也可以有荧光强弱的分辨，从而具有很高的特异性和灵敏度。
[0024]④本发明的试纸条较之现有的仪器分析和ELISA试剂盒，其费用大大降低，而与常规的胶体金试纸条相比，还具有更好的稳定性和准确性，且与量子点荧光试纸条相比也有荧光效率高，制备和偶联简单且稳定和抗背景信号干扰等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1是本发明一较佳实施例中强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条(如下简称“试纸条”)的结构示意图，其中，1-衬板、2-样品垫、3-结合垫、4-吸水垫、5-包被膜、6-检测线、7-对照线、8-样品垫；
图2是本发明一较佳实施例中三种上转换荧光纳米材料(简称材料1-材料3)在波长为980nm的光源激发下的发光图谱。【具体实施方式】
[0026]以下结合一较佳实施例及相应的附图对本发明的技术方案作进一步的说明。
[0027]本实施例所涉及的强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条(以下简称“试纸条”)的制备过程包括:
首先制取上转换荧光纳米材料；
而后，制取上转化荧光-双酚A抗体复合物，用于制备相应的上转换荧光探针结合垫； 以及，利用羊抗兔或羊抗鼠IgG抗体等制备对照线。
[0028]更为具体的讲，该试纸条制备工艺可以包括如下主要步骤:
(I)制备上转换荧光纳米材料
通过水热法制备上转换荧光纳米材料:首先把1.2g Na0H、9mL水、IOmL乙醇、20mL油酸混合，然后加入0.6mol的稀土氯化物后再搅拌混合，在此基础上再将4mL浓度为IM的NaF溶液逐滴加入，并继续搅拌IOmin后加入50mL的反应釜中，密封后160°C下加热8h。然后停止加热并冷却到室温，产物沉淀到底部后先用环己烷溶解再用乙醇和水进行洗涤，离心分离。接着用乙醇洗涤3次。最后在真空中干燥，获得疏水性的上转换荧光纳米材料(Upconversion Nanoparticles 简称 “UCNPs，，)。
[0029]在0.1g的疏水性UCNPs加入100 mL环己烷、70mL叔丁醇、IOmL水、5mL浓度为5wt%的K2CO3溶液后搅拌20min,然后把20mL含5.7M KMnO4和0.105M NaIO4的水溶液逐滴加入并在40°C下搅拌48h。反应好后将产物离心分离、水洗。离心好后再加入50 mL pH值4-5的HCl溶液再搅拌30min，最后再离心洗涤，获得具有球形结构的粒径为30_50nm的亲水性的上转换荧光纳米材料。
[0030]但需要说明的是，显然的，本领域技术人员亦可通过其他习见的制备方法或市售途径等获得相同或相似的上转换荧光纳米材料，例如，可采用图2所涉及的三种上转换荧光纳米材料。
[0031](2)生物分子的偶联
先用5mg亲水性UCNPs、5mg 1-乙基-3-(3- 二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)、15mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在室温下搅拌8h，然后离心洗涤，把得到的沉淀溶解在包含2mg/mL抗体的PBS缓冲液中，链接反应在4°C进行48h，之后用赖氨酸除去多余的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。最后经过离心分离洗涤得到上转化荧光-双酚A抗体复合物。
[0032](3)重悬上转化荧光-双酚A抗体复合物
把上述上转换荧光纳米材料-双酚A抗体复合物用重悬液重悬，所述重悬液为可含蔗糖、吐温20、牛血清蛋白、聚乙二醇的0.01mol/L pH值9.0的磷酸盐缓冲液；
(4)制备结合垫
将上转换荧光纳米材料-双酚A抗体复合物重悬叶按照1:10?50的体积比稀释后喷着于玻璃纤维膜上，37°C条件下干燥，制得吸附有上转换荧光探针的结合垫；
(5)制备包被膜
在硝酸纤维膜上用双酚A包被抗原溶液喷制检测线T线，以及用羊抗兔或羊抗鼠IgG溶液喷制对照线C线，两条线平行排列；
(6)试纸条的组装
将样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫由一端依次粘附在衬板上，即得到目标产品，即，强抗基质干扰型用于生物样品中双酚A快速检测的上转换荧光层析试纸条(简称“试纸条”)。
[0033]对于前述步骤(5 )和(6 )，其进一步可以为:
(5)将0.5mg/mL的包被抗原及羊抗兔或羊抗鼠IgG喷在包被膜上，分别作为检测线(T)和控制线(C)。将一定浓度的上转换荧光标记抗体滴到在结合垫上，在37°C下干燥；
(6)参阅图1，在2mm宽的衬板上按顺序放上样品垫、上转换荧光结合垫、包被膜和吸水垫，获得目标产品，然后将其与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。
[0034](4)检测操作方法:将检测的试剂滴在样品垫上，使其通过液体的毛细作用移动到检测线和控制线，几分钟后检测荧光。
[0035]结果判定:如果在包被膜上仅有C线一条荧光线显现，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有双酚A ;如果在包被膜上C线和T线两条荧光线都显现，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含双酚A或含量低于检测限；如果在包被膜上C线荧光线不显现，则表明试纸条已失效。
[0036]藉由本发明的试纸条，能够快速、灵敏、简便的检测出复杂样品中的双酚A。
[0037]最后应说明的是，以上实施方案仅用以说明本发明装置的技术方案，而非对其限制；尽管前述方案对本发明装置进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述方案所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明装置方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条，包括在衬板上依次衔接的样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫吸附有主要由能在波长为980nm的光源激发下发出短波长可见光区域发射光的上转换荧光纳米材料与双酚A抗体形成的上转化荧光-双酚A抗体复合物，所述包被膜上间隔分布有检测标记和对照标记， 其中，所述上转化荧光-双酚A抗体复合物包括上转换荧光标记的双酚A多克隆抗体或上转换荧光标记的双酹A单克隆抗体， 所述检测标记包括以双酚A包被抗原溶液在包被膜上印制的检测线，所述对照标记包括以羊抗兔或羊抗鼠IgG抗体溶液在包被膜上印制的对照线，所述检测线与对照线平行分布， 所述双酚A包被抗原包括双酚酸与载体蛋白人血清白蛋白的耦联物。
2.根据权利要求1所述的强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条，其特征在于所述样品垫和/或结合垫的材料包括玻璃纤维棉。
3.根据权利要求1所述的强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条，其特征在于所述衬板的材料主要由不吸水的韧性材料形成，所述韧性材料包括硬质塑胶条。
4.根据权利要求1所述的强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条，其特征在于所述包被膜包括硝酸纤维素膜。
5.根据权利要求1所述的强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条，其特征在于所述吸水垫包括吸水滤纸。
6.一种强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤:` (1)提供上转换荧光纳米材料，并在上转换荧光纳米材料修饰用以与双酚A抗体偶联的活性基团，而后将双酚A抗体与上转换荧光纳米材料偶联，获得上转化荧光-双酚A抗体复合物，而后将上转化荧光-双酚A抗体复合物施加至结合垫上； (2)以双酚A包被抗原溶液和羊抗兔或羊抗鼠IgG抗体溶液分别在包被膜上印制形成平行分布的检测线与对照线； (3)将样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫依次衔接且附着在衬板上，获得目标产品。
7.根据权利要求6所述强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条的制备方法，其特征在于还包括: 将疏水性的上转化荧光纳米材料氧化形成亲水性的上转化荧光纳米材料，而后将上转化荧光纳米材料上的羧基活化，使之与双酚A抗体上的氨基结合形成肽键，从而实现上转化荧光纳米材料与双酚A抗体的偶联。
8.根据权利要求6所述强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条的制备方法，其特征在于所述样品垫和/或结合垫的材料包括玻璃纤维棉； 所述衬板的材料主要由不吸水的韧性材料形成，所述韧性材料包括硬质塑胶条； 所述包被膜包括硝酸纤维素膜； 所述吸水垫包括吸水滤纸。
9.一种强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (I)将1.2g NaOH、9mL水、IOmL乙醇、20mL油酸混合，然后加入0.6mol的稀土氯化物后再搅拌混合，在此基础上再将4mL浓度为IM的NaF逐滴加入，并继续搅拌IOmin后加入.50mL的反应釜中，密封后160°C下加热8h，然后停止加热并冷却到室温，产物沉淀到底部后先用环己烷溶解再用乙醇和水进行洗涤，离心分离，接着用乙醇洗涤3次，最后在真空中干燥，获得疏水性上转换荧光纳米材料， 而后，将0.1g疏水性上转换荧光纳米材料与100 mL环己烷、70mL叔丁醇、1OmL水、5mL浓度为5wt%的K2CO3溶液混合后搅拌20min，然后逐滴加入20mL含5.7M KMnO4和0.105M的NaIO4的水溶液，并在40°C下搅拌48h，反应完成后，分离出固形物，并清洗,而后再加入.50 mL pH值4-5的HCl溶液并搅拌30min，最后再次分离出固形物，并洗涤，获得具有球形结构的、粒径为30-50nm的亲水性上转换荧光纳米材料； (2)将5mg亲水性上转换荧光纳米材料、5mg1-乙基-3-(3- 二甲基胺丙基)碳化二亚胺、15mg N-羟基琥珀酰亚胺在室温下搅拌8h，然后离心洗涤，将所获得沉淀物溶解在包含2mg/mL抗体的PBS缓冲液中，链接反应在4°C进行48h，之后用赖氨酸除去多余的N-羟基琥珀酰亚胺，最后经过离心分离、洗涤得到上转化荧光-双酚A抗体复合物； (3)将上转化荧光-双酚A抗体复合物以重悬液重悬，所述重悬液为浓度在0.01mol/L，pH值9.0的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液中还含有蔗糖、吐温20、牛血清蛋白和聚乙二醇； (4)将步骤(3)所获上转化荧光-双酚A抗体复合物重悬液按照1:10~50的体积比稀释后喷着于玻璃纤维膜上，37°C条件下干燥，制得吸附有上转换荧光探针的结合垫； (5)在硝酸纤维膜上以浓度为0.5mg/mL双酚A包被抗原溶液喷制检测线，以及用羊抗兔或羊抗鼠IgG溶液喷制对照线，两条线平行排列，并在37°C下干燥； (6)将样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次粘附在衬板上，获得所述强抗基质干扰型双酚A上转换荧光层析试纸条。
【文档编号】G01N33/558GK103869063SQ201410109117
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】陈伟, 黄琳, 赵弟萍, 姚丽 申请人:合肥工业大学