一种降钙素原检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种降钙素原检测试剂盒。试剂盒包含2株特异性降钙素原单克隆抗体。多孔板上包被的单克隆抗体与生物素标记的单克隆抗体以及被测样本的降钙素原形成“包被抗体-抗原-生物素标记抗体”的夹心复合物结构。抗体上所标记的生物素与HRP标记的链霉亲和素结合，HRP进而与底物反应产生信号，用以进行PCT定量分析。通过本发明的试剂盒，使得能够迅速、灵敏地定量检测样本中的降钙素原含量。
【专利说明】一种降钙素原检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子免疫学领域，具体涉及一种检测样本中降钙素原含量的试剂盒。【背景技术】
[0002]降I丐素原(procalcitonin, PCT)是1996年开展起来的用于检测细菌感染所致炎症反应的较好指标之一。它是无激素活性的降钙素(calcitonin，CT)前肽物质，由116个氨基酸组成、分子量为13kD。PCT的半衰期为25h?30h，在体内外稳定性很好。PCT是严重细菌性炎症和真菌感染的特异性指标，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标。
[0003]PCT在全身性炎症反应(2h?3h后)早期即可升高，因此具有早期诊断价值。在局部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症、癌性发热、移植物宿主排斥反应或自身免疫性等疾病时PCT水平不增加或轻微增加，而只在严重的全身系统性感染时才明显增加，这就决定了 PCT的高度特异性。因此也可用于各种临床情况的鉴别诊断。PCT水平和炎症严重程度成正相关，并随着炎症的控制和病情的缓解而降低至正常水平，因而PCT又可作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标。
[0004]PCT在健康人血液中含量极低，< 0.05ng/ml。在临床实践中0.5ng/ml被认为是诊断全身性感染的分界值。因此，对试剂盒的灵敏度要求极高。
[0005]现有方法如CN201210464257.3所制备的试剂盒灵敏度为0.lng/ml。CN201210273085.1中试剂盒的最低检测限为0.2ng/ml。CN201110210250.4分析灵敏度为
0.15ng/mL。较理想的灵敏度目前仅在磁颗粒化学发光法中可见，如CN201110201457.5试剂盒的分析灵敏度为0.05ng/mL,以及CN200710073309.3试剂盒的分析灵敏度为0.05ng/ml。但是，对于操作更简单、试剂稳定性更号、成本更低廉的ELISA法而言，目前尚未见到灵敏度能达到这种程度的试剂盒。
【发明内容】
[0006]根据一些实施方式，提供了一种检测样本中降钙素原的ELISA试剂盒，其包含:
[0007]包被有第一降钙素原单克隆抗体的多孔板、
[0008]试剂1、
[0009]试剂2、
[0010]试剂3、
[0011]样本稀释液、和
[0012]底物液。
[0013]在一些实施方案中，包被有第一降钙素原单克隆抗体的多孔板中第一降钙素原单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8798的杂交瘤细胞所产生。
[0014]在一些实施方案中，试剂I也作生物素标记的降钙素原单克隆抗体工作液。其包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，小牛血清、生物素标记的第二降钙素原单克隆抗体和防腐剂。在一些实施方案中，第二降钙素原单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8799的杂交瘤细胞所产生。
[0015]第二降钙素原单克隆抗体能特异性识别并结合样本中的PCT，抗体上所标记的生物素与HRP标记的链霉亲和素结合，HRP进而与底物反应产生信号。产生的信号换算成PCT浓度，用于定量分析。
[0016]在一些实施方案中，试剂2用作生物素标记抗体的稀释液、或用作辣根过氧化物酶标记链霉亲和素的稀释液。在一些实施方案中，试剂2包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，小牛血清、和防腐剂。在具体实施方案中，IOOOml的试剂2中包含5.8g磷酸氢二钠、
0.593g磷酸二氢钠、8.0g氯化钠、200ml小牛血清和0.5ml Proclin-300。
[0017]在一些实施方案中，试剂3用作辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液。在一些实施方案中，试剂3包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、和防腐剂。
[0018]在一些实施方案中，样本稀释液包含Tris碱、氯化钠、氯化钙和防腐剂。在具体实施方案中，IOOOml样本稀释液是IOX的，其包括22.4g/L Tris碱、81.8g/L氯化钠、5mlPix)Clin-300和2.9g/L无水氯化钙。样本稀释液可以配制成浓缩型，也可以不是。技术人员可以理解，其它浓缩倍数也包括在本发明范围内。
[0019]在一些实施方案中，底物液包含:辣根过氧化物酶底物。在具体实施方案中，底物液包含底物液A和底物液B。底物液A是含有过氧化脲的柠檬酸缓冲液。底物液B是含有TMB的柠檬酸缓冲液。
[0020]应当理解，本发明的各试剂可以配制成浓缩型，也可以不是。在一些实施方案中，各试剂配制成浓缩型，这可以减少运输、储存体积。技术人员可以理解，其它浓缩倍数也包括在本发明范围内。
[0021]在一些实施方案中，样本来自哺乳动物，优选来自人类。样本选自全血、血浆、和血清。在具体实施方案中，样本为人血清。
[0022]在一些实施方案中，本发明的试剂盒还可以根据需要包括校准品。校准品用于标准曲线的绘制。校准品为已知降钙素原浓度的血清，降钙素原浓度在0-3200pg/ml范围内。在具体实施方案中，校准品中降钙素原浓度分别为50、100、200、400、800、3200pg/ml。
[0023]在一些实施方案中，本发明的试剂盒还可以根据需要包括质控品。质控品为已知降钙素原浓度的血清，降钙素原浓度在40-2000pg/ml范围内。在具体实施方案中，质控品中降I丐素原浓度分别为 800pg/ml - 1200pg/ml ;40pg/ml-60pg/ml。
[0024]在一些实施方案中，校准品或质控品中的血清可以是任何市售血清、或收集自临床机构的人血清，其经灭活处理，并且抗-TP、HBsAg、抗-HCV和抗-HIV均为阴性。
[0025]根据一些实施方案，提供了一种降钙素原单克隆抗体，其由保藏号为CGMCCN0.8798的杂交瘤细胞所产生。
[0026]根据另一些实施方案，提供了一种降钙素原单克隆抗体，其由保藏号为CGMCCN0.8799的杂交瘤细胞所产生。
[0027]根据一些实施方案，提供了本发明的降钙素原单克隆抗体在制备ELISA诊断试剂中的用途。在一个具体实施方案中，保藏号为CGMCC N0.8798和8799的杂交瘤细胞所产生2株降钙素原单克隆抗体共同用于制备ELISA诊断试剂。[0028]根据一些实施方案，提供了保藏号为CGMCC N0.8798的杂交瘤细胞。
[0029]根据另一些实施方案，提供了保藏号为CGMCC N0.8799的杂交瘤细胞。
[0030]根据一些实施方案，提供了一种抗原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。根据另一些实施方案，提供了一种抗原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0031]在具体的实施方案中，本发明的抗原多肽分别有效制备了本发明的2株高特异性降钙素原单克隆抗体。因此，提供了抗原多肽、或其组合在制备降钙素原单克隆抗体中的用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1:采用本发明的试剂盒绘制的校准曲线。
【具体实施方式】[0033]为了使本发明易于理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。
[0034]实施例1.PCT重组蛋白的制备
[0035]从NCBI数据库中获得PCT编码序列(NCBI登录号BC069684.1),构建原核表达载体pET28-PCT，诱导表达PCT重组抗原，经Western blot分析蛋白有免疫反应，镍亲和层析柱纯化大量制备PCT重组蛋白。
[0036]1.pET28-PCT表达载体构建
[0037]PCT基因购买于武汉三鹰生物技术有限公司，参照PCT cDNA序列设计引物:
[0038]PCT-F:GCGGATCCGCACCATTCAGGTCTG (SEQ IDN0.1)；
[0039]PCT-R:CGCTCGAGTTAGTTGGCATTCTG (SEQ IDN0.2)。
[0040]PCR扩增PCT基因，PCR体系:
[0041]
2x缓冲液(LATag) 20 μL
PCT-F2 μL
PCT-R2 μL
模板I μL
H2O1、μL
[0042]PCR 程序:
[0043]94°C IOminI 个循环
[0044]94°C 30s,55°C 30s,72°C 30s30 个循环
[0045]72°C IOminI 个循环
[0046]PCR产物使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后与T载体连接，16 °C连接I h获得PCT-T,转化大肠杆菌DH5 α。PCT-T载体经酶切鉴定后，送公司测序。
[0047]测序正确的PCT-T载体与pET28a表达载体经BanmH I和Xho I酶切3h后，
[0048]
【权利要求】
1.一种检测样本中降钙素原的ELISA试剂盒，其包含: 包被有第一降钙素原单克隆抗体的多孔板、 试剂1、 试剂2、 试剂3、 样本稀释液、和 底物液； 其中: 试剂I包含:磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、生物素标记的第二降钙素原单克隆抗体、和防腐剂； 试剂2包含:磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、和防腐剂； 试剂3包含:磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、和防腐剂； 样本稀释液包含=Tris碱、氯化钠、氯化钙、和防腐剂； 底物液包含:辣根过氧化物酶底物； 第一降钙素原单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8798的杂交瘤细胞所产生， 第二降钙素原单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8799的杂交瘤细胞所产生； 样本来自哺乳动物，优选人类，样本选自全血、血浆、和血清。
2.根据权利要求1所述的检测样本中降钙素原的ELISA试剂盒，还包括: 校准品，校准品为已知降钙素原浓度的血清，降钙素原浓度在0-3200pg/ml范围内。
3.根据权利要求1所述的检测样本中降钙素原的ELISA试剂盒，还包括质控品，质控品为已知降钙素原浓度的血清。
4.一种检测样本中降钙素原的ELISA试剂盒，其包含: 包被有第一降钙素原单克隆抗体的多孔板、 试剂1、 试剂2、 试剂3、 样本稀释液、和 底物液； 其中: 试剂I包含:5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、和12.5mg/L生物素标记的第二降钙素原单克隆抗体； 试剂2包含:5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、和 0.5ml/L Proclin-300 ； 试剂3包含:5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、和12mg/L辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素； 样本稀释液包含:22.4g/L Tris碱、81.8g/L氯化钠、2.9g/L无水氯化钙和5ml/LProclin-300 ； 底物液由底物液A和底物液B组成，底物液A含有过氧化脲和柠檬酸缓冲液，底物液B含有四甲基联苯胺和柠檬酸缓冲液； 第一降钙素原单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8798的杂交瘤细胞所产生，第二降钙素原单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8799的杂交瘤细胞所产生。
5.—种降钙素原单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC N0.8798的杂交瘤细胞所产生。
6.一种降钙素原单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC N0.8799的杂交瘤细胞所产生。
7.选自如下一种或两种的降钙素原单克隆抗体在制备ELISA诊断试剂中的用途: 由保藏号为CGMCC N0.8798的杂交瘤细胞所产生的降钙素原单克隆抗体、 由保藏号为CGMCC N0.8799的杂交瘤细胞所产生的降钙素原单克隆抗体。
8.一种杂交瘤细胞，其选自保藏号为CGMCC N0.8798、和CGMCC N0.8799的杂交瘤细胞。
9.一种抗原多肽，其选自: 氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示的抗原多肽、和 氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示的抗原多肽。
10.权利要求9所 述的抗原多肽在制备降钙素原单克隆抗体中的用途。
【文档编号】G01N33/68GK103913579SQ201410110849
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】于晖, 李雨心, 王旭, 李鑫, 陈勤慧, 刘琦, 孙佳 申请人:北京普恩光德生物科技开发有限公司