抗牛γ干扰素双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法
【专利摘要】抗牛γ干扰素双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法，属于生物技术检测领域，从杂交瘤细胞株BovinIFNgamma-3E1分泌获得抗牛γ干扰素单克隆抗体3E1，从杂交瘤细胞株BovinIFNgamma-6E5分泌获得抗牛γ干扰素单克隆抗体6E5，将抗牛γ干扰素单克隆抗体3E1包被在酶标板上，在抗牛γ干扰素单克隆抗体6E5上标记酶。以此制备具有包被抗牛γ干扰素单克隆抗体3E1的酶标板和酶标记抗牛γ干扰素单克隆抗体6E5的检测牛γ干扰素的双抗体夹心ELISA试剂盒，具有操作简便，不需要精密仪器，普通实验室即可进行的特点。
【专利说明】抗牛Y干扰素双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测牛Y干扰素的双抗体夹心ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002]干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，一般由干扰素诱导剂诱导产生，它是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，其类型分为三类，α-(白细胞)型、(成纤维细胞)型，Y-(淋巴细胞)型；它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。干扰素可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。
[0003]干扰素(IFN)作为一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制。
[0004]牛结核病是由牛结核分枝杆菌所引起的一种慢性消耗性传染病，可通过病畜传播给人类或其它动物。结核病除了感染人外，还能感染50多种哺乳动物和20多种禽类。牛结核病在世界各国均有发生，在我国依然是常见的多发性疾病，其传播流行不但影响到畜牧业的持续发展，更严重影响着人类的健康。目前，国内外用于诊断牛结核病的检验方法，大体上可分为三类:一是细菌学检验方法，如涂片镜检、细菌培养和动物接种等；第二类为采用分子生物学检验方法，如生物探针法、PCR法等；第三类是采用免疫学方法检测，如皮内变态反应、ELISA和ELISP0T法等。皮内变态反应曾在牛结核病的诊断与防治过程中发挥了重要的作用，但该方法的欠缺之处在于干扰结核病检疫的因素很多，既有物理性的，也有化学性的，更多的是非典型分支杆菌的干扰，因为各分支杆菌均表现出相互交叉的变态反应，常造成非特异性反应的发生。世界各国都倾力于牛结核病的快速诊断方法研究，建立了一些新型、快速、准确、可靠的检测方法，并在这个领域取得了瞩目的进展。20世纪90年代Wood等证明牛结核分枝杆菌侵染机体后会刺激机体淋巴细胞形成记忆淋巴细胞，使淋巴细胞致敏，将无菌采集到的牛血用牛结核分枝杆菌的特异性抗原(BPPD)再次刺激，就会导致全血中的致敏淋巴细胞被活化，释放出大量的Y-干扰素，因此可以通过检测牛全血上清中的Y-干扰素来达到检测牛结核病的目的。这种全血Y干扰素测定法已显示出能为人、猴、牛、水牛、绵羊和山羊等动物一系列疾病的诊断提供快速灵敏的手段，并且牛Y干扰素测定法的广泛性田间试验已在世界上许多国家(包括澳大利亚、爱尔兰、新西兰、阿根廷、西班牙、意大利和美国)完成，正逐步取代结合菌素皮内试验，Y-干扰素诊断法的敏感性为81.8%?100%，特异性为94%?100%，比皮试更敏感。然而，建立快速、准确、敏感、特异以及简便的诊断方法的关键是高特异性和亲和力的单克隆抗体的获得。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种快速、准确、敏感、特异以及简便的诊断方法的检测牛Y干扰素双抗体夹心ELISA试剂盒。[0006]本发明包括:
(1)包被抗牛Y干扰素单克隆抗体3E1(捕获抗体)的酶标板；
(2)酶标记抗牛Y干扰素单克隆抗体6E5(检测抗体)；
其中，包被在酶标板的抗牛Y干扰素单克隆抗体与酶标记抗牛Y干扰素单克隆抗体分别针对牛Y干扰素不同表位。
[0007]此外，本发明试剂盒还可以包括以下试剂中的一种或多种:稀释液、洗涤液、底物显色液、终止液等。
[0008]运用本发明检测试剂盒可检测天然的牛Y干扰素，以及人工表达的重组牛Y干扰素。本发明为牛细胞免疫研究和牛结核病的快速检测提供了可靠的手段。本发明试剂盒便于操作、使用成本低、重复性好，适合大规模推广应用。
[0009]本发明以合成肽和GST-牛Y干扰素纯化的蛋白作为抗原制备抗牛Y干扰素单克隆抗体，得到一系列不同抗原表位的单克隆抗体，通过进一步筛选，结果获得2株针对牛Y干扰素抗原不同表位的杂交瘤细胞株，该细胞株分泌的单克隆抗体效价高，特异性强，检测反应性效果好。
[0010]本发明为牛Y干扰素的快速检测提供了可靠的手段。该试剂盒操作简便、快速，可以用于牛细胞免疫学研究和牛结核病的快速检测。适用于高等学校，科研单位、市级以上兽医部门和出入境检验检疫局的科学研究和牛结核病的检测。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。
[0011]本发明还提出以上试剂盒的制备方法:` 从杂交瘤细胞株Bovin IFN gamma_3El分泌获得抗牛、干扰素单克隆抗体3E1,从杂交瘤细胞株Bovin IFN gamma_6E5分泌获得抗牛、干扰素单克隆抗体6E5,将抗牛、干扰素单克隆抗体3E1包被在酶标板上，在抗牛Y干扰素单克隆抗体6E5上进行酶标记。
[0012]包被在酶标板的抗牛Y干扰素单克隆抗体3E1为杂交瘤细胞株Bovin IFNgamma-3El (分类命名:杂交瘤细胞株，保藏号:CGMCC N0.7105)分泌获得；酶标记抗牛、干扰素单克隆抗体6E5为杂交瘤细胞株Bovin IFN gamma-6E5 (分类命名:杂交瘤细胞株，保藏号:CGMCC N0.7104)分泌获得。
[0013]本发明所述酶标记抗牛Y干扰素单克隆抗体6E5，是采用商品化酶标记试剂盒通过辣根过氧化物酶标记而成。
[0014]单克隆抗体可按照如下方法包被到酶标板:将单克隆抗体用碳酸氢钠缓冲液稀释到0.35Pg/mL，按?οομL孔加入到酶标板中，4°C放置12_16h，用PBST洗涤后，用5%脱脂乳、350μL7孔，37 °C封闭2h，再用PBST洗涤。
【具体实施方式】
[0015]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0016]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0017]1.抗牛Y干扰素单克隆抗体的细胞株
抗牛Y干扰素单克隆抗体细胞株Bovin IFN gamma_3El,分类命名:杂交瘤细胞株，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏号=CGMCC N0.7105，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0018]抗牛Y干扰素单克隆抗体细胞株Bovin IFN gamma_6E5,分类命名:杂交瘤细胞株，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏号=CGMCC N0.7104，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0019]包被在酶标板的抗牛Y干扰素单克隆抗体为上述杂交瘤细胞株Bovin IFNgamma-3El (细胞保藏号:CGMCC N0.7105)分泌获得。
[0020]酶标记抗牛Y干扰素单克隆抗体为上述杂交瘤细胞株Bovin IFN gamma_6E5(细胞保藏号=CGMCC N0.7104)分泌获得。[0021]2.抗牛Y干扰素单克隆抗体3E1和6E5的制备
(I)将保存的能分泌抗牛Y干扰素单克隆抗体杂交瘤细胞株Bovin IFN gamma_3El(分类命名:杂交瘤细胞株，保藏号=CGMCC N0.7105)的细胞株从液氮中取出，37°C复苏，待细胞生长状态良好后，准备制备小鼠腹水抗体。即取10周龄Balb/c母鼠，腹腔注射石蜡油，每只注射0.5ml，10天后，取用DMEM培养基稀释杂交瘤细胞，每只小鼠腹腔注射300万杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显膨大后采腹水，将采集的腹水1000Orpm离心5min，取上清，于_20°C保存。用protein G亲和柱纯化抗体并测定浓度和效价，分装，_70°C冻存。
[0022](2)将保存的能分泌抗牛Y干扰素单克隆抗体杂交瘤细胞株Bovin IFNgamma-6E5 (分类命名:杂交瘤细胞株，保藏号:CGMCC N0.7104)的细胞株从液氮中取出，37°C复苏，待细胞生长状态良好后，准备制备小鼠腹水抗体。即取10周龄Balb/c母鼠，腹腔注射石蜡油，每只注射0.5ml, 10天后，取用DMEM培养基稀释杂交瘤细胞，每只小鼠腹腔注射300万杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显膨大后采腹水，将采集的腹水1000Orpm离心5min，取上清，于_20°C保存。用protein G亲和柱纯化抗体并测定浓度和效价，分装，_70°C冻存。
[0023]3.抗牛Y干扰素单克隆抗体6E5的酶标记
用Thermo公司的辣根过氧化物酶标记试剂盒对纯化好并能与天然牛Y干扰素反应的单抗6E5进行标记。具体的步骤如下:将Img的IgG溶于体积为0.5-lml的PBS中；再将Img 的 lyophilized EZ-Link Plus Activated Peroxidase 溶解在 100mL 的去离子水中，然后将IgG加到其中；即刻加入10μ1的Sodium Cyanoborohydride于反应体系中，让其室温反应I小时；然后加入20μ1 quenching Buffer,让其室温反应15分钟；将标记好的样品用GE公司的Protein G柱纯化。
[0024]4.酶标板包被抗牛Y干扰素单克隆抗体3E1
(1)将抗牛Y干扰素单克隆抗体3E1用碳酸盐缓冲液稀释至0.35Pg/mL，取100μL7孔的量加入ELISA板中，4°C包被约12h，再37°C水浴包被30~60 min ；
(2)弃包被液，IXPBST洗涤I次，加入5%的脱脂乳，37°C水浴，封闭2h；
(3 )弃去封闭液，用I X PBST洗涤3次，待检测用。
[0025]5.天然牛Y干扰素的诱导产生 牛全血培养
①米血
无菌采集至少5mL牛血液，抗凝，轻轻颠倒几次充分混合。采血后30个小时内进行培养。注:抗凝血不能贮存于冰箱中。[0026]②血液培养
血液培养前轻轻颠倒，充分混匀。由于本试验需要活的淋巴细胞，因此需要将细胞损伤降至最低。将抗凝血加入24孔培养板，每头动物加两孔，每孔1.5mL (见下表)。用一次性自动移液器或吸管在无菌条件下进行操作。
[0027]吸取血液或刺激原至24孔培养板的推荐操作
【权利要求】
1.抗牛Y干扰素双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于包括: 1)包被抗牛Y干扰素单克隆抗体3E1的酶标板； 2)酶标记抗牛Y干扰素单克隆抗体6E5; 其中，包被在酶标板的抗牛Y干扰素单克隆抗体3E1与酶标记抗牛Y干扰素单克隆抗体6E5分别针对牛Y干扰素不同的抗原表位。
2.如权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于:从杂交瘤细胞株BovinIFNgamma_3El分泌获得抗牛\干扰素单克隆抗体3E1,从杂交瘤细胞株Bovin IFN gamma_6E5分泌获得抗牛Y干扰素单克隆抗体6E5，将抗牛Y干扰素单克隆抗体3E1包被在酶标板上，在抗牛Y干扰素单克隆抗体6E5上进行酶标记。
【文档编号】G01N33/68GK103869084SQ201410132953
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】秦爱建, 黄健, 邵红霞, 钱锟, 黄大卢 申请人:扬州大学