甜菜胚珠切割透明制片方法
【专利摘要】甜菜胚珠切割透明制片方法，涉及一种胚珠切割透明制片方法。本发明是要解决现有观察甜菜胚囊的方法处理量大，费时、费力的问题。方法：一、取样及固定；二、整体染色；三、用解离液解离，再用蒸馏水冲洗；四、把解离后的甜菜花蕾放置在培养皿内，用解剖针在解剖镜下将胚珠从子房中分离出来，在距胚珠珠孔端1/3处对胚珠进行切割；五、将分离切割后留下的株孔端1/3部分放在载玻片上，滴透明剂，再滴硼砂洋红染色液，静置；六、制片。该方法快速省时，极大的减少了工作量，实验效果良好，成本低，易于操作。本发明方法用于观察甜菜胚囊。
【专利说明】甜菜胚珠切割透明制片方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胚珠切割透明制片方法。
【背景技术】
[0002]从胚胎学角度观察植物胚囊的变化以了解其发生机制，是植物学中常用的方法。被子植物的雌配子体也称胚囊，甜菜胚囊位于子房及胚珠多层细胞的包围之中，甜菜胚珠是厚珠心(6-7层)，给研究大孢子母细胞发生发育的工作带来很大的难度。
[0003]石蜡切片法是研究植物胚囊最常用的方法之一，效果好，可是工作量极大且实验周期较长。该方法包埋材料完整，为了观察胚囊的发育情况，找到大孢子母细胞，需要连续切片、费时费力，往往选一张好的制片需要淘汰成千上万张制备好的切片，工作量极大，给实验带来了不小的难度。
【发明内容】
[0004]本发明是要解决现有观察甜菜胚囊的方法处理量大，费时、费力的问题，提供一种甜菜胚珠切割透明制片方法。
[0005]本发明甜菜胚珠切割透明制片方法，按以下步骤进行:
[0006]一、取样及固定:取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后将甜菜花蕾浸泡在体积浓度为70%的乙醇溶液中，贮存在4°C冰箱中备用，其中每IOOmL FPA固定液由5mL福尔马林、5mL丙酸和90mL体积浓度为50%的乙醇溶液组成；
[0007]二、整体染色:将步骤一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋红染色液中进行整体染色，染色时间为4?5d，染色后用溶液A浸泡5?8分钟，再用体积浓度为70%的乙醇溶液冲洗至呈现透明的红色；
[0008]三、然后用解离液解离，解离时间为5?lOmin，再用蒸馏水冲洗2?3次；
[0009]四、把步骤三解离后的甜菜花蕾放置在培养皿内，用解剖针在解剖镜下将胚珠从子房中分离出来，然后在距胚珠珠孔端1/3处对胚珠进行切割，保留珠孔端的1/3部分；
[0010]五、将分离切割后留下的株孔端1/3部分放在载玻片上，滴一滴透明剂，然后在透明剂中滴一滴硼砂洋红染色液，静置2?3min ；
[0011]六、制片:胚珠透明染色后盖上盖玻片，用记号笔在盖玻片上做一标记确认株孔端的方位，压片排除盖玻片内的气泡，在已做过标记的珠孔方向敲击，即完成制片。
[0012]本发明的有益效果:
[0013](I)本发明方法是利用解剖镜直接剥离胚囊分离胚珠，并将分离出来的胚珠进行再次切割，只保留珠孔端一小部分进行制片，胚珠其余大部分被废弃掉，大大减少了视野下胚珠体细胞的数量，增加了观察大孢子母细胞的准确度，极大的减少了工作量，更易于找到大孢子母细胞。
[0014](2)本发明的方法简便易行，不用太多仪器设备，解剖镜和普通光学显微镜即可进行分离和观察。[0015](3)本发明的方法所用的解离液比酶解法用的果胶酶、纤维素酶成本低得多，盐酸、酒精1:1即可达到解离目的，且解离效果好，有效降低了实验成本。
[0016](4)本发明方法的效果好，易于操作和掌握，降低了制片难度，提高了工作效率，省时省力。
[0017]此方法也同样适用于万寿菊(Tagetes erecta L)、矮牵牛(Petunia hybridaVilm)等其它花卉植物。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为实施例中观察到的甜菜大孢子母细胞照片；图2为实施例中观察到的甜菜的单核胚囊照片；图3为实施例中观察到的甜菜二核胚囊的早期照片。
【具体实施方式】
[0019]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0020]【具体实施方式】一:本实施方式甜菜胚珠切割透明制片方法，按以下步骤进行:
[0021]一、取样及固定:取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后将甜菜花蕾浸泡在体积浓度为70%的乙醇溶液中，贮存在4°C冰箱中备用，其中每IOOmL FPA固定液由5mL福尔马林、5mL丙酸和90mL体积浓度为50%的乙醇溶液组成；
[0022]二、整体染色:将步骤一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋红染色液中进行整体染色，染色时间为4?5d，染色后用溶液A浸泡5?8分钟，再用体积浓度为70%的乙醇溶液冲洗至呈现透明的红色；
[0023]三、然后用解离液解离，解离时间为5?lOmin，再用蒸馏水冲洗2?3次；
[0024]四、把步骤三解离后的甜菜花蕾放置在培养皿内，用解剖针在解剖镜下将胚珠从子房中分离出来，然后在距胚珠珠孔端1/3处对胚珠进行切割，保留珠孔端的1/3部分；
[0025]五、将分离切割后留下的株孔端1/3部分放在载玻片上，滴一滴透明剂，然后在透明剂中滴一滴硼砂洋红染色液，静置2?3min ；
[0026]六、制片:胚珠透明染色后盖上盖玻片，用记号笔在盖玻片上做一标记确认株孔端的方位，压片排除盖玻片内的气泡，在已做过标记的珠孔方向敲击，即完成制片。
[0027]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤二所述溶液A的配制方法为:每IOOmL体积浓度为70%的乙醇溶液中加入9?11微升质量分数为37%的盐酸。其它与【具体实施方式】一相同。
[0028]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是:步骤二所述硼砂洋红染色液的配制方法为:首先取2?3g洋红粉末加到IOOmL质量浓度为4%的硼砂水溶液中，加热煮沸30min，静置3d后用等体积的体积浓度为70%的乙醇溶液稀释，然后再静置24h后过滤备用。其它与【具体实施方式】一或二相同。
[0029]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一至三之一不同的是:步骤三所述解离液由体积浓度为95%的乙醇溶液和质量分数为37%的盐酸按体积比1:1混合。其它与【具体实施方式】一至三之一相同。
[0030]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是:步骤五所述透明剂为乳酚甘油，所述乳酚甘油由20mL乳酸、20mL酚、40mL甘油和20mL蒸馏水组成。其它与【具体实施方式】一至四之一相同。
[0031]实施例:
[0032]本实施例甜菜胚珠切割透明制片方法，按以下步骤进行:
[0033]一、取样及固定:取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后将甜菜花蕾浸泡在体积浓度为70%的乙醇溶液中，贮存在4°C冰箱中备用，其中每IOOmL FPA固定液由5mL福尔马林、5mL丙酸和90mL体积浓度为50%的乙醇溶液组成；
[0034]二、整体染色:将步骤一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋红染色液中进行整体染色，染色时间为5d，染色后用溶液A浸泡5分钟，再用体积浓度为70%的乙醇溶液冲洗至呈现透明的红色；
[0035]三、然后用解离液解离，解离时间为8min，再用蒸馏水冲洗3次；
[0036]四、把步骤三解离后的甜菜花蕾放置在培养皿内，用解剖针在解剖镜下将胚珠从子房中分离出来，然后在距胚珠珠孔端1/3处对胚珠进行切割，保留珠孔端的1/3部分；
[0037]五、将分离切割后留下的株孔端1/3部分放在载玻片上，滴一滴透明剂，然后在透明剂中滴一滴硼砂洋红染色液，静置3min ；
[0038]六、制片:胚珠透明染色后盖上盖玻片，用记号笔在盖玻片上做一标记确认株孔端的方位，压片排除盖玻片内的气泡，在已做过标记的珠孔方向敲击，即完成制片。
[0039]步骤二所述溶液A的配制方法为:每IOOmL体积浓度为70%的乙醇溶液中加入10微升质量分数为37%的盐酸。
[0040]步骤二所述硼砂洋红染色液的配制方法为:首先取2g洋红粉末加到IOOmL质量浓度为4%的硼砂水溶液中，加热煮沸30min，静置3d后用等体积的体积浓度为70%的乙醇溶液稀释，然后再静置24h后过滤备用。
[0041]步骤三所述解离液由体积浓度为95%的乙醇溶液和质量分数为37%的盐酸按体积比1:1混合。
[0042]步骤五所述透明剂为乳酚甘油,所述乳酚甘油由20mL乳酸、20mL酚、40mL甘油和20mL蒸馏水组成。
[0043]按照本实施例的方法可以清晰观察到甜菜胚囊发育的各个阶段:单核期胚囊(大孢子母细胞)、二核期胚囊(此时胚囊中分化出一个大液泡)、成熟胚囊具有7胞8核:中部含有2个极核的中央细胞、株孔端有3个核组成的卵器、核点端的3个核形成反足细胞。成熟胚囊的两个极核靠近卵器，反足细胞分化成多细胞团。
[0044]在普通光学显微镜下观察到的甜菜大孢子母细胞如图1所示，甜菜的单核胚囊如图2所示，甜菜二核胚囊的早期照片如图3所示。
[0045]使用本实施例的方法观察大孢子母细胞，快速省时，极大的减少了工作量，实验效果良好，成本低，易于操作。
【权利要求】
1.甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于该方法按以下步骤进行: 一、取样及固定:取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后将甜菜花蕾浸泡在体积浓度为70%的乙醇溶液中，贮存在4°C冰箱中备用，其中每IOOmL FPA固定液由5mL福尔马林、5mL丙酸和90mL体积浓度为50%的乙醇溶液组成； 二、整体染色:将步骤一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋红染色液中进行整体染色，染色时间为4?5d，染色后用溶液A浸泡5?8分钟，再用体积浓度为70%的乙醇溶液冲洗至呈现透明的红色； 三、然后用解离液解离，解离时间为5?lOmin，再用蒸馏水冲洗2?3次； 四、把步骤三解离后的甜菜花蕾放置在培养皿内，用解剖针在解剖镜下将胚珠从子房中分离出来，然后在距胚珠珠孔端1/3处对胚珠进行切割，保留珠孔端的1/3部分； 五、将分离切割后留下的株孔端1/3部分放在载玻片上，滴一滴透明剂，然后在透明剂中滴一滴硼砂洋红染色液，静置2?3min ； 六、制片:胚珠透明染色后盖上盖玻片，用记号笔在盖玻片上做一标记确认株孔端的方位，压片排除盖玻片内的气泡，在已做过标记的珠孔方向敲击，即完成制片。
2.根据权利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步骤二所述溶液A的配制方法为:每IOOmL体积浓度为70%的乙醇溶液中加入9?11微升质量分数为37%的盐酸。
3.根据权利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步骤二所述硼砂洋红染色液的配制方法为:首先取2?3g洋红粉末加到IOOmL质量浓度为4%的硼砂水溶液中，加热煮沸30min，静置3d后用等体积的体积浓度为70%的乙醇溶液稀释，然后再静置24h后过滤备用。
4.根据权利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步骤三所述解离液由体积浓度为95%的乙醇溶液和质量分数为37%的盐酸按体积比1:1混合。
5.根据权利要求1所述的甜菜胚珠切割透明制片方法，其特征在于步骤五所述透明剂为乳酚甘油，所述乳酚甘油由20mL乳酸、20mL酚、40mL甘油和20mL蒸馏水组成。
【文档编号】G01N1/30GK103868779SQ201410136044
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】刘丽萍, 王艳, 孙元 申请人:黑龙江大学