一种BP180 NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种皮肤基底膜抗BP180?NC16A?IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法，属于IgE检测试剂【技术领域】。该试剂盒包括检测底物。该检测方法应用了该试剂盒。试剂盒及检测方法的有益效果在于，灵敏度高且具有特异性。
【专利说明】—种BP180NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及IgE检测试剂【技术领域】，特别涉及一种皮肤基底膜带抗BP180NC16AIgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]现有技术中对没有皮肤基底膜抗BP180NC16A IgE抗体的间接检测试剂盒及应用该试剂盒对皮肤基底膜带抗BP180NC16A IgE抗体进行检测的方法。而应用现有技术对该抗体进行检测的方法通常过程复杂，耗时很多。
【发明内容】
[0003]为了解决上述问题，本发明提出了一种灵敏度高且具有特异性的皮肤基底膜带抗BP180NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法。
[0004]本发明提供的皮肤基底膜抗BP180NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒，包括检测底物，所述检测底物的制备方法包括以下步骤:
[0005]将人皮肤或猴食管上皮切成1X0.5cm长方形，长轴垂直固定于冷冻切片冷冻头上；
[0006]调整冷冻切片机冷冻箱及冷冻台温度至_20°C，切片厚度8 μ m后开始切片，皮肤切片附着于防脱玻璃载玻片上，每片粘附两块皮肤组织，距离尽可能远；
[0007]切好的载玻片迅速浸于丙酮中固定5min，取出晾干后放入标本盒，存入-80°C超低温冰箱，得到所述检测底物。
[0008]本发明提供的一种皮肤基底膜带抗BP180NC16AIgE抗体的间接免疫荧光检测方法包括以下步骤:
[0009]采用复孔检测，向本发明提供的的试剂盒的检测底物中加入倍比稀释的待测样本及一份阴性对照血清，所述阴性对照为经蛋白印迹法检测不含BP180NC16A IgE抗体的血清，在37°C恒温条件下一抗孵育，Ih后用PBST第I次洗涤；
[0010]用PBS将FITC标记的鼠抗人IgE抗体原液稀释500倍，得到二抗稀释液；
[0011]向经过第I次洗涤的检测底物中加入所述二抗稀释液，在37°C恒温条件下二抗孵育，Ih后用PBST第II次洗涤；
[0012]向经过第II次洗板的检测底物中加入甘油，终止反应；
[0013]显色终止后以倒置荧光显微镜观察皮肤基底膜带处是否有线状荧光沉积，无基底膜线状沉积者为阴性，有基底膜线状沉积者为阳性。
[0014]作为优选，所述待测样本为经过PBS倍比稀释的血清或者水疱液。
[0015]本发提供的皮肤基底膜带IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒及检测方法的有益效果在于，灵敏度高且具有特异性。【具体实施方式】
[0016]为了深入了解本发明，下面结合附图及具体实施例对本发明进行详细说明。
[0017]本发明提供的皮肤基底膜带IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒包括检测试剂，检测试剂的制备方法包括以下步骤:
[0018]步骤11:经患者知情同意并签署知情同意书后，取手术切除人包皮皮肤或乳房皮肤，分离皮肤与皮下组织。皮肤或猴食管上皮可冻存于-80°C超低温冰箱。
[0019]步骤12:将人皮肤或猴食管上皮切成1X0.5cm长方形，长轴垂直固定于冷冻切片冷冻头上。
[0020]步骤13:调整冷冻切片机冷冻箱及冷冻台温度至_20°C，切片厚度8 μ m后开始切片，皮肤切片应附着于防脱玻璃载玻片上，每片可粘附两块皮肤组织，距离尽可能远。
[0021]步骤14:切好的载玻片迅速浸于丙酮中固定5min，取出晾干后放入标本盒，存入-80°C超低温冰箱。由此可得检测底物。
[0022]本发明提供的BP180NC16A IgE抗体的酶联免疫检测方法包括以下步骤:
[0023]步骤21:采用复孔检测，向本发明提供的试剂盒的皮肤底物中加入待测样本及一份阴性对照血清，其中，阴性对照为经蛋白印迹法检测不含BP180NC16AIgE抗体的健康人血清，在37°C恒温条件下一抗孵育，Ih后用PBST第I次洗涤；
[0024]其中，待测样本为经过PBS倍比稀释的血清或者水疱液。
[0025]步骤21’:用PBS将FITC标记的IgE抗体原液稀释500倍，得到二抗稀释液；
[0026]步骤22:向经过第I次洗涤的试剂盒的载玻片皮肤底物中加入所述二抗稀释液，在37 °C恒温条件下二抗孵育，Ih后用PBST第II次洗涤；
[0027]步骤23:向经过第II次洗板的试剂盒的皮肤底物中加入甘油，终止反应；
[0028]步骤24:显色终止后以倒置荧光显微镜观察皮肤基底膜带处是否有线状荧光沉积，无基底膜线状沉积者为阴性，有线状沉积者记录其最后出现线状沉积的血清或疱液稀释倍数。
[0029]实施例
[0030](一)材料
[0031]标本:
[0032]血清样本(或水疱样本)
[0033]待测样本:来源于待检测的BP患者或疑诊BP患者
[0034]阴性对照血清:经蛋白印迹法检测确定的不含有抗皮肤基底膜带IgE抗体的患者的血清
[0035]人包皮或乳房皮肤，或猴食管上皮
[0036]主要试剂:
[0037]冷冻包埋剂PBS
[0038]FITC-1gE抗体PBST终止液(甘油)
[0039]所需耗材:
[0040]
【权利要求】
1.一种皮肤基底膜抗BP180NC16A IgE抗体的间接免疫荧光检测试剂盒，包括检测底物，其特征在于，所述检测底物的制备方法包括以下步骤: 将人皮肤或猴食管上皮切成1X0.5cm长方形，长轴垂直固定于冷冻切片冷冻头上；调整冷冻切片机冷冻箱及冷冻台温度至_20°C，切片厚度8 μ m后开始切片，皮肤切片附着于防脱玻璃载玻片上，每片粘附两块皮肤组织，距离尽可能远； 切好的载玻片迅速浸于丙酮中固定5min，取出晾干后放入标本盒，存入-80°C超低温冰箱，得到所述检测底物。
2.一种皮肤基底膜带抗BP180NC16AIgE抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 采用复孔检测，向权利要求1所述的试剂盒的检测底物中加入倍比稀释的待测样本及一份阴性对照血清，所述阴性对照为经蛋白印迹法检测不含BP180NC16A IgE抗体的血清，在37 °C恒温条件下一抗孵育，Ih后用PBST第I次洗涤； 用PBS将FITC标记的鼠抗人IgE抗体原液稀释500倍，得到二抗稀释液； 向经过第I次洗涤的检测底物中加入所述二抗稀释液，在37°C恒温条件下二抗孵育，Ih后用PBST第II次洗涤； 向经过第II次洗板的检测底物中加入甘油，终止反应； 显色终止后以倒置荧光显微镜观察皮肤基底膜带处是否有线状荧光沉积，无基底膜线状沉积者为阴性，有基底膜线状沉积者为阳性。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本为经过PBS倍比稀释的血清或者水疱液。
【文档编号】G01N21/64GK103913567SQ201410136829
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】左亚刚, 刘冰, 孙秋宁 申请人:中国医学科学院北京协和医院