一种用于预测急性脑梗死患者发生微出血的试剂的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物检测领域，涉及一种预测急性脑梗死患者发生微出血的试剂。该试剂由检测脂联素、E-选择素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化终产物受体sRAGE中的任意一种，或多种的试剂组成。检测脑梗死患者静脉血中的脂联素、E-选择素、S100B以及可溶性晚期糖基化终产物受体的含量，从而早期判断患者是否可能发生微出血，为早期干预提供了依据。
【专利说明】—种用于预测急性脑梗死患者发生微出血的试剂
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测领域，涉及一种预测急性脑梗死患者发生微出血的试剂。
【背景技术】
[0002]脑微出血是脑内微小血管病变所致的以微小量出血为主要特点的脑实质亚临床损害。在梯度回波T2加权成像上，微出血表现为一个或多个斑点状信号缺失灶，直径2-5mm，周围无水肿。组织病理学证实，信号缺失主要是因纤维透明样变性的微动脉血液微量外渗，导致含铁血红素的沉积所致。研究表明脑微出血与年龄、心血管危险因素、脑白质变性、脑卒中、脑淀粉样血管病变、认知功能障碍、卒中后情感障碍有一定关系，脑微出血与缺血性卒中、脑出血和溶栓或抗栓治疗后症状性脑出血关系密切。
[0003]早期的前瞻性研究提示脑微出血有可能增加急性脑梗死溶栓后出血转化的风险。而最近一些研究则显示脑微出血与溶栓后出血转化并不存在相关性。Kim等对急性脑梗死患者在发病3小时内行静脉tPA溶栓或发病6小时内行动脉尿激酶溶栓治疗，研究显示脑微出血的数目并不是超急性期脑梗死溶栓后出血转化的独立危险因素。但该试验中脑微出血数目大于10的患者仅为5例，可能对结果有影响。Fiehler等对570例发病6小时内给予静脉溶栓治疗的患者的研究显示，86例患者在溶栓前基线期发现有脑微出血，其中6例患者的脑微出血数目大于5个。该86例患者中有5例(5.8%)发生出血转化，无脑微出血的患者中有13例(2.7%)出现出血转化，差异无统计学意义。该研究指出，与既往文献报道的溶栓治疗的获益率(?10%)相比，即使脑微出血的患者发生出血转化的风险轻微升高，也不可能超过溶栓带来的益处；同时由于具有多个脑微出血的患者人数较少，脑微出血的数目与出血转化的关系尚有待进一步证实。该研究是目前最大的多中心合作的回顾性研究，但该研究在脑微出血评估、统计学方法的选择及统计效力、对不同部位的脑微出血的潜在作用的评价等方面仍存在不足，其结论尚有待于进一步验证。对于脑卒中后的抗栓治疗，目前的研究显示脑微出血可能与抗栓治疗后的出血转化有关，但其风险-获益比值目前尚不明确。在此基础上，微出血的存在可以对缺血性卒中患者选择使用祛聚、抗凝及溶栓药物提供指导。
[0004]脂联素(adiponectin)是由脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽。大量存在于血液循环中。脂联素又被称作ACrp30、apMl、AdipOQ、GBP28。脂联素能够影响脂肪和糖类的代谢、调节血管内皮细胞功能、抗炎，在脑血管病的发生和发展中起着重要的神经和血管保护作用。
[0005]E-选择素(E-selectin)是选择素家族的一员，是一类Ca2+依赖的细胞粘着分子，能与特异糖基识别并结合。主要参与白细胞与血管内皮细胞之间的识别与粘着。E-选择素存在于活化的血管内皮细胞表面，又称内皮细胞黏附分子-1。微出血的发生可能与血管内皮功能紊乱导致血脑屏障(BBB)的通透性增高有关，一旦内皮损伤就会导致BBB通透性增力口，血液成分外渗，出现点状出血，E-选择素随着激活的内皮细胞数量增加而表达量增高。
[0006]S100B是SlOO蛋白家族的一员，为神经胶质细胞特异性的蛋白，主要表达在星形胶质细胞，尤其是那些包裹血管内皮细胞的星形胶质细胞。神经系统发生损伤时，SlOOB从损伤细胞释放至血管外间隙，通过BBB进入血液，导致血液中的S100B蛋白水平增高。
[0007]可溶性晚期糖基化终产物受体(sRAGE)是晚期糖基化终产物受体(RAGE)的可溶性成分。RAGE是晚期糖基化终产物的信号传导受体，是细胞表面免疫球蛋白超家族中的一种多配体受体，在许多细胞中表达。其无糖化的内源性配体包括促炎分子S100B、HMGB-U淀粉样蛋白多肽和b2整合蛋白巨噬细胞抗原复合体-1等。sRAGE与RAGE有部分相似的结构，可与其配体结合，竞争性抑制RAGE的活性。因此，能保护细胞免受RAGE-配体轴所介导的损害性反应。此外，sRAGE还可作为循环中AGEs和其他RAGE配体的清道夫受体。
[0008]如何预测脑梗死患者是否发生微出血，目前尚无确定方法，仅有一些临床评分量表，但是准确性与特异性均不高，且尚未在我国人群中验证其效度。目前尚无可供预测微出血发生的生化检测手段。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于预测急性脑梗死患者发生微出血的试剂。
[0010]本发明的目的可通过以下技术方案实现:
[0011]一种用于预测急性脑梗死患者发生微出血的试剂，由检测脂联素、E-选择素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化终产物受体sRAGE中的任意一种，或多种的试剂组成，优选由检测脂联素、E-选择素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化终产物受体sRAGE中的任意一种，或多种的ELISA试剂组成。
[0012]检测脂联素的ELISA试剂包括生物素偶联的人脂联素特异性抗体、人脂联素蛋白标准品、链霉亲和素偶联的HRP复合物、联苯胺反应底物等。
[0013]检测E-选择素的ELISA试剂包括生物素偶联的人E-选择素特异性抗体、人E-选择素蛋白标准品、链霉亲和素偶联的HRP复合物、联苯胺反应底物等。
[0014]检测S100B蛋白的ELISA试剂包括生物素偶联的人S100B特异性抗体、人S100B蛋白标准品、链霉亲和素偶联的HRP复合物、联苯胺反应底物等。
[0015]检测sRAGE的ELISA试剂包括生物素偶联的人sRAGE特异性抗体、人sRAGE蛋白标准品、链霉亲和素偶联的HRP复合物、联苯胺反应底物等。
[0016]上述ELISA试剂可自制，也可购买商品化的相应抗体和ELISA试剂盒。
[0017]脂联素、E-选择素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化终产物受体sRAGE中的任意一种或多种在制备预测急性脑梗死患者发生微出血的试剂中的应用。
[0018]预测急性脑梗死患者发生微出血的生物分子组合，由脂联素、E-选择素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化终产物受体sRAGE中的任意两种、或两种以上组成。
[0019]有益效果:
[0020]脑梗死患者静脉血中的脂联素、E-选择素、S100B以及可溶性晚期糖基化终产物受体的含量与脑微出血的发生具有显著的相关性，本发明提供的检测试剂对脑微出血有很好的预测价值，为早期干预脑微出血提供了依据。
【具体实施方式】[0021]实施例
[0022]I资料与方法
[0023]1.1研究对象
[0024]研究对象为2012年I月至2012年8月期间在南京军区南京总医院住院的首发缺血性卒中患者，以及同期因头痛、头晕健康体检志愿者做为对照组，均完成MRI (3.0T)磁敏感序列(SWI)扫描。神经功能缺损程度由两位不知影像学检查结果的神经内科医生采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分。入组标准如下=(I)NIHSS评分<8分；(2)在发病I周内入院；(3)无MRI检查禁忌症(例如体内存在磁性金属物质)。排除标准如下:(O肾脏或肝脏疾病；(2)有急性或慢性炎症性疾病，如肺炎、脑膜炎等，最近使用任何消炎药；(3)恶性肿瘤或脑部手术。收集所有受试者的基线资料，如性别、年龄、吸烟史、饮酒史、既往史以及用药史。
[0025]1.2MRI检查方法
[0026]MRI检查采用Siemens公司3.0T MRI机,行自旋回波常规序列、三维时间飞跃血管成像以及GER-T2*WI和SWI序列扫描。SWI扫描参数为:矩阵298x448 ;检查区域230mmX 184mm,层厚1.5mm,重复时间、回波时间分别为28ms和20ms,激励I次。微出血定义为直径2-10_的低信号缺失，边界清楚，周围无水肿。排除苍白球钙化、蛛网膜下腔低信号影和血管流空影等。缺血性卒中患者根据有无微出血分为两组。微出血按照部位分为深部、脑叶和幕下。并按照微出血数量分级:无微出血、轻度(微出血总数I至5个)、中度(6至15个)和重度(大于15个)。以上影像学结果由2名对患者临床资料不知情的神经影像科医生分析。
[0027]1.3ELISA法检测脂联素、E-选择素、S100B和sRAGE
[0028]入院患者次日晨空腹采集患者肘正中静脉血2ml，而对照组为门诊空腹采血均置于EDTA抗凝管中，1500转/分钟离心10分钟后，分离血浆，置于_80°C冰箱存储备用。脂联素、E-选择素、S100B和sRAGE检测方法基本相同，脂联素检测试剂盒购自美国Millipore公司，E-选择素试剂盒购自eBioscience公司，S100B检测试剂盒购自BioVendor公司，sRAGE检测试剂盒购自R&D公司，均按试剂盒说明书流程进行操作。以下以S100B为例具体说明。
[0029]①加样:将不同浓度的标准品(50pg/ml,100pg/ml, 200pg/ml, 500pg/ml, IOOOpg/ml，2000pg/ml)、稀释缓冲液(空白对照)、待检血清样本以100微升/孔的量加入酶标板内，设置2个复孔。盖上封板膜，室温(25°C)孵育2小时。
[0030]②洗板:扣去孔内液体，300微升/孔加入洗脱液；停留I分钟后弃去孔内液体。重复3次，最后一次在滤纸上扣干。
[0031]③加检测抗体:100微升/孔加入稀释后的生物素偶联的一抗。盖上封板膜，室温(25°C)孵育1-1.5小时。
[0032]④洗板:扣去孔内液体，300微升/孔加入洗脱液；停留I分钟后弃去孔内液体。重复3次，最后一次在滤纸上扣干。
[0033]⑤加酶:100微升/孔加入Str印tavidin-HRP。盖上封板膜，室温孵育30分钟。
[0034]⑥洗板:扣去孔内液体，300微升/孔加入洗脱液；停留I分钟后弃去孔内液体。重复3次，最后一次在滤纸上扣干。[0035]⑦显色:100微升/孔加入TMB，室温避光孵育5_30分钟。根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。通常显色10-20分钟可以达到很好的效果。
[0036]⑧终止反应:迅速100微升/孔加入终止液终止反应。
[0037]⑨读板:终止后10分钟内，以酶标仪用检测波长450nm读值，得出每孔的OD值。
[0038]2统计学分析
[0039]应用SPSS16.0软件进行统计分析，正态分布计量资料以均数土标准差(x土s)表示，采用独立样本t检验或单因素方差分析，非正态分布计量资料比较用Kruskal-Wallis或Mann - Whitney U检验,计数资料比较用X2检验或Fisher检验。将与微出血严重程度有关的因素进行单因素分析后P < 0.2变量再行等级Logistic回归分析。此外，在微出血组采用偏相关分析，并校正可能的混杂因素，如年龄，性别，他汀类药物的使用等。P < 0.05为差异有统计学意义。
[0040]3 结果
[0041]3.1患者的一般人口学资料
[0042]共有170例患者被纳入本研究，平均年龄63.9岁，其中男性109例，占64.1%。81人患者发现出现微出血，占47.6%。其中单发微出血27例，占33.3%，多发微出血54例，占66.7%。患者病史情况及主要实验室检查情况见表I。
[0043]3.2E-选择素与微出血的相关性分析
[0044]住院期间发生微出血的患者入院时的血清E-选择素明显高于未发生微出血的患者的血清E-选择素数值。Logistic回归分析显示，在校正了血压、HDL和纤维蛋白原后，E-选择素仍与微出血正相关(OR:1.12，95%C1:1.03-1.17)。若以12为截断点，则诊断敏感性为60%，特异性为74%。
[0045]3.3脂联素与微出血的相关性分析
[0046]住院期间发生微出血的患者入院时的血清脂联素明显低于未发生微出血的患者的血清脂联素数值。Logistic回归分析显示，在校正了血压、HDL和纤维蛋白原后，脂联素仍与微出血负相关(OR:0.54，95%C1:0.36-0.82)。若以300为截断点，则诊断敏感性为72%，特异性为83%。
[0047]3.4S100B与微出血的相关性分析
[0048]住院期间发生微出血的患者入院时的血清S100B明显高于未发生微出血的患者的S100B数值。Logistic回归分析显示，在校正了血压、HDL和纤维蛋白原后，S100B仍与微出血正相关(OR:2.1，95%CI:1.8-4.3)。若以100为截断点，则诊断敏感性为85%，特异性为 94%ο
[0049]3.5sRAGE与微出血的相关性分析
[0050]住院期间发生微出血的患者入院时的血清sRAGE明显低于未发生微出血的患者的血清sRAGE数值。Logistic回归分析显示，在校正了血压、HDL和纤维蛋白原后，sRAGE仍与微出血负相关(OR:0.32，95%C1:0.24-0.48)。若以900为截断点，则诊断敏感性为92%，特异性为88%。
[0051]3.6联用2种检测指标与微出血的相关性分析
[0052]各指标截断点同上。
[0053]若联用脂联素+E-选择素，则诊断敏感性为79%，特异性为60%。[0054]若联用脂联素+S100B，则诊断敏感性为88%，特异性为74%。
[0055]若联用脂联素+sRAGE,则诊断敏感性为96%，特异性为68%。
[0056]若联用E-选择素+S100B，则诊断敏感性为89%，特异性为54%。
[0057]若联用E-选择素+sRAGE,则诊断敏感性为94%，特异性为62%。
[0058]若联用SlOOB+sRAGE，则诊断敏感性为97%，特异性为69%。
[0059]3.7联用3种检测指标与微出血的相关性分析
[0060]各指标截断点同上。
[0061]若联用脂联素+E-选择素+S100B，则诊断敏感性为95%，特异性为45%。
[0062]若联用脂联素+E-选择素+sRAGE,则诊断敏感性为97%，特异性为51%。
[0063]若联用脂联素+SlOOB+sRAGE，则诊断敏感性为96%，特异性为63%。
[0064]若联用E-选择素+SlOOB+sRAGE,则诊断敏感性为96%，特异性为79%。
[0065]3.8联用4种检测指标与微出血的相关性分析
[0066]各指标截断点同上。
[0067]若联用脂联素+E-选择素+SlOOB+sRAGE,则诊断敏感性为98%，特异性为39%。
[0068]表1.患者基本临床资料比较
[0069]
【权利要求】
1.一种用于预测急性脑梗死患者发生微出血的试剂，其特征在于由检测脂联素、E-选择素、SlOOB蛋白以及可溶性晚期糖基化终产物受体sRAGE中的任意一种，或多种的试剂组成。
2.根据权利要求1所述的用于预测急性脑梗死患者发生微出血的试剂，其特征在于由检测脂联素、E-选择素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化终产物受体sRAGE中的任意一种，或多种的ELISA试剂组成。
3.根据权利要求2所述的用于预测急性脑梗死患者发生微出血的试剂，其特征在于检测脂联素的ELISA试剂包括生物素偶联的人脂联素特异性抗体、人脂联素蛋白标准品、链霉亲和素偶联的HRP复合物、联苯胺反应底物；检测E-选择素的ELISA试剂包括生物素偶联的人E-选择素特异性抗体、人E-选择素蛋白标准品、链霉亲和素偶联的HRP复合物、联苯胺反应底物；检测S100B蛋白的ELISA试剂包括生物素偶联的人S100B特异性抗体、人S100B蛋白标准品、链霉亲和素偶联的HRP复合物、联苯胺反应底物；检测sRAGE的ELISA试剂包括生物素偶联的人sRAGE特异性抗体、人sRAGE蛋白标准品、链霉亲和素偶联的HRP复 合物、联苯胺反应底物。
4.脂联素、E-选择素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化终产物受体sRAGE中的任意一种或多种在制备预测急性脑梗死患者发生微出血的试剂中的应用。
5.预测急性脑梗死患者发生微出血的生物分子组合，其特征在于由脂联素、E-选择素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化终产物受体sRAGE中的任意两种、或两种以上组成。
【文档编号】G01N33/68GK103901214SQ201410137088
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】叶瑞东, 朱武生, 刘新峰 申请人:刘新峰