用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法
【专利摘要】本发明涉及一种细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力检验方法。本发明主要涉及一种用将猪瘟疫苗稀释后接种适宜的敏感传代细胞，然后使用抗原捕获ELISA检测不同稀释度疫苗中活病毒在感染细胞后增殖的子代病毒，计算疫苗病毒的最高细胞感染剂量，建立了猪瘟疫苗病毒的细胞感染量（CID）的效力检验方法；比对效力检验，用本发明提供CID法和现行质量标准兔体感染量检测结果分别为：12批猪睾丸细胞系源猪瘟活疫苗每头份均含4×105CID和2.6～3.0×104RID之间，3批牛睾丸原代细胞源猪瘟活疫苗每头份均低于4×104CID和7.0～8.0×103RID；试验证明：本实验室建立的ELISA检测CID的结果与现行质量标准兔体感染量检测结果存在良好的相关性，能够较好反映疫苗中活病毒的含量，有望成为RID的替代方法。
【专利说明】用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法
【技术领域】
[0001]本专利涉及一种用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法。属于兽用生物制品领域。
【背景技术】
[0002]猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种猪的烈性传染性疾病，感染后的临床症状受不同因素的影响而变化多样，从急性死亡到隐性感染均可能出现，是危害我国养猪业的一种重要动物疫病，目前主要以点状散发流行为主，流行范围极广，全国各个养猪地区几乎均有发生。我国对于猪瘟的防控措施主要以猪瘟活疫苗大规模免疫为主，这是猪瘟大规模爆发得以控制的主要原因。
[0003]我国猪瘟兔化弱毒株制备的猪瘟活疫苗是国际上公认的最安全、有效的猪瘟疫苗之一，应用十分广泛，在对猪瘟的防控中起到了重要的作用，其具有对不同日龄猪均安全、诱导免疫反应快和可以保护猪只抵抗猪瘟病毒强毒株的攻击等优点。猪瘟兔化弱毒疫苗在理论上能够产生极佳的免疫效果，但是为了能够在临床使用时发挥疫苗的最大作用，就必须实现对商品化疫苗质量的有效控制。疫苗质量控制的一个重要方面就是要保证所生产疫苗具有符合标准的活病毒效价，能够确实激活被免疫动物的免疫系统。疫苗效力的定义为疫苗接种动物获得保护自身抵抗感染的能力，或在接种疫苗动物体内诱导产生的抗体转移到后代使新生动物获得保护的能力。对于弱毒疫苗而言，对宿主的免疫效力是通过病毒感染宿主细胞激活免疫系统而实现的，在一定范围内，感染宿主的疫苗毒越多，对宿主免疫系统的激活就越强。因此，猪瘟兔化弱毒疫苗的效价是可以通过确定疫苗中有感染性病毒的数量(浓度)来衡量的。
[0004]在我国猪瘟兔化弱毒疫苗效价的判定目前采用的是以兔体定型热法和猪免疫攻毒为基础的动物试验的方法，其中以兔体定型热法的应用最为广泛。但是该方法存在很多弊端，如:检测结果易受兔体个体差异和环境因素影响、费时费力并且成本较高等。建立不依赖动物试验的效检替代方法是大势所趋，也势在必行。对于活疫苗而言，疫苗的效价(滴度)取决于疫苗中含有的有感染性微生物数量(浓度)。产生满意效果的最小滴度是建立在测定最小有效剂量研究的基础上。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于建立一种不使用实验动物的、重复性高的、能够有效反映猪瘟疫苗中有感染性病毒粒子数量(浓度)的效检替代方法
[0006]本发明实施的技术方案
[0007]1.一种用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法，其特征在于:该方法是将传代猪瘟疫苗稀释后接种适宜的细胞系，疫苗中的猪瘟兔化弱毒株病毒通过细胞增殖后用于病毒细胞感染量的测定，该方法检测到的活的具有感染性的猪瘟病毒兔化弱毒病毒，其检测结果与疫苗免疫原性直接相关；
[0008]2.该效检方法是用猪瘟活疫苗中的猪瘟兔化弱毒株病毒感染细胞后的上清液或细胞裂解液用于病毒感染量的测定；
[0009]3.该检验方法是用猪瘟抗原捕捉ELISA检测感染细胞中猪瘟病毒兔化弱毒株病毒抗原，评价疫苗中病毒的细胞感染量，该方法特异性强，重复性好；
[0010]4.该检验方法的检测样品是用细胞系包括猪睾丸细胞、猪肾细胞等扩繁的猪瘟兔化弱毒株病毒，此类细胞适合猪瘟病毒增殖。
[0011]本发明的具体描述
[0012]一、效检方法的建立
[0013](一)检验样品的制备
[0014]按常规方法消化生长良好的猪睾丸细胞系(ST细胞)，按适当细胞密度接种若干细胞培养瓶(板)。置于37°C，5%C02温箱中培养48h至细胞长至良好单层。将猪瘟活疫苗用细胞维持液做10倍系列稀释至10_7。将10_4?10_7稀释度的猪瘟兔化弱毒分别接种已培养48h长至80%?100%单层的正常ST细胞。每个稀释度分别接种4瓶ST细胞，每瓶细胞接种4mL稀释后的病毒液，留4瓶正常ST细胞以细胞维持液代替病毒液做相同的接毒处理作为空白对照，置于37°C、5%C02温箱中孵育4h后，吸弃病毒液，用维持液润洗三次后(每次以4mL维持液润洗)更换为6mL新鲜维持液，置于37°C、5%C02温箱中培养。4d后第一次收毒换液，每个稀释度取一瓶细胞收获一半的细胞培养液上清，剩余上清液连同细胞直接置于-20°C冻结，反复冻融三次收获病毒液，其余每瓶细胞弃去旧维持液更换新鲜维持液6mL,置于37°C、5%C02温箱中继续培养。此后每隔4d按上述方法收毒换液一次,最后一次收获时，取一半的细胞培养液上清收获，另一半上清液连同细胞置于-20 V冻结保存，冻融三次收获病毒液。共收获4次。所有收获的样品全部置于_20°C保存待用。
[0015]对以上制备的所有检测样品采用抗原捕获ELISA (或称ELISA)进行检测，并对所得到的检测结果进行比较。
[0016](二)检测方法
[0017]1.猪瘟抗原捕捉ELISA检测感染细胞中猪瘟病毒
[0018](I)样品的准备
[0019]消化生长良好的ST细胞，扩大接种细胞培养瓶(板孔)，置于37°C，5%C02温箱中培养48h至细胞长至良好单层。
[0020]取猪瘟活疫苗冻干制品做10倍系列稀释至10_7，取10_4?10_7稀释度分别接种已培养48h长至80%?100%单层的ST细胞。置于37°C，5%C02温箱中吸附4h后，吸弃毒液，更换为含2%血清的MEM维持液，置于37°C，5%C02温箱中培养。每种疫苗设空白细胞对照。
[0021]4d后做第I次收毒换液，以后每隔4d再收毒换液I次,连续收获4次,最后一次收获时，吸取一半的上清液，另一半上清液连同细胞一起冻结保存。所有收获的毒液置于-20 °C保存待检。
[0022](2)待检样品的ELISA检测
[0023]按照IDEXX猪瘟病毒抗原扑捉ELISA检测试剂盒/血清的说明书的说明对以上第(I)项中制备的各收次样品进行ELISA检测。所有样品均采用37°C孵育2h。为了探索裂解液(BVDVSerumPlus)对检测的影响，对部分样品用不同比例的裂解液处理后进行ELISA检测。
[0024](3)ELISA检测操作步骤方法:按照IDEXX猪瘟病毒抗原扑捉ELISA检测试剂盒/血清的说明书的说明书进行(见附件I)。
[0025]结果判定
[0026]①被检样品的S-N值等于或小于0.100时，判为猪瘟病毒抗原阴性。
[0027]②被检样品的S-N值大于0.100，小于或等于0.300，判为可疑，之后可用猪瘟病毒特异性方法进行确认。
[0028]③被检样品的S-N值大于0.300时，判为猪瘟病毒抗原阳性。
[0029](三)效检 用样品收次、收获方式和判定标准的确定
[0030]采用猪瘟病毒抗原血清检测试剂盒/血清(IDEXX, USA产品)对系列稀释的疫苗接种ST细胞培养后的第一次、第二次、第三次和第四次收获(简称一收、二收、三收和四收)的所有样品进行检测，按说明书(见附件I)对阴性、阳性和可疑样品进行判定。采用两种样品处理方式进行检测，一种为样品原液不经过裂解液处理直接检测，一种使用IDEXX公司提供的裂解液与样品原液1:1混合裂解处理后进行检测。比较裂解液处理对检测结果的影响。以确定适用于效检的样品收次和收获方式(结果见表1)。
[0031]表1猪瘟病毒兔化弱毒株接种细胞后一~四收样品检测结果
[0032]
【权利要求】
1.一种用检测猪瘟疫苗中所含病毒细胞感染量来评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法，其特征在于:该方法是将猪瘟疫苗中猪瘟兔化弱毒稀释后接种适宜的细胞系，通过细胞增殖一定时间后用于疫苗中病毒细胞感染剂量的测定，该方法检测到的是活的具有感染性的猪瘟兔化弱毒，其检测结果与疫苗免疫原性直接相关。
2.如权利要求1所述的一种用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法，其特征在于:是用猪瘟疫苗病毒感染细胞后12天收获的细胞上清或细胞裂解液用于猪瘟疫苗中病毒细胞感染剂量的测定。
3.如权利要求1所述的一种细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力检验的方法，其特征在于该检验方法是用猪瘟抗原捕捉ELISA检测感染细胞中猪瘟病毒抗原，评价疫苗活病毒的细胞感染量，该方法特异性强，可排除死亡病毒和消除非特异性。
4.如权利要求1所述的一种用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法，其特征在于该检验方法是猪瘟兔化弱毒细胞感染量测定用传代细胞包括猪睾丸细胞、猪肾细胞等，该类细胞适合猪瘟病毒增殖。
【文档编号】G01N33/569GK103954760SQ201410146130
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】宁宜宝, 王海光, 林旭埜, 冯忠泽, 张毓金, 吴文福, 赖月辉, 陈坚, 王芳, 陈瑞爱, 孙进忠, 漆世华 申请人:中国兽医药品监察所, 广东永顺生物制药股份有限公司