高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于抗生素分析【技术领域】，公开了一种利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法及其应用。该方法包含以下步骤：（1）对样品进行预处理，得到待检测液；（2）将待检测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离；（3）计算分离出的残留磺胺类抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出残留的含量。本发明利用磺胺类药物在高效液相色谱仪紫外检测器和荧光检测器不同激发波长下最优的检测效果，优化检测条件的组合及样品预处理方法，建立水、土壤及植物中残留磺胺类抗生素的检测方法。本发明方法检测效率高，一次分离4种磺胺类抗生素，无主要干扰物干扰，分析速度快，可以满足日常快速定量检测的需求。
【专利说明】高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于抗生素分析【技术领域】，特别涉及一种利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]磺胺类抗生素具有对氨基苯磺酰胺结构，是一种人工合成的广谱抗菌药，通过阻止细菌利用对氨基苯甲酸合成叶酸而抑制细菌的生长繁殖，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有较好的抗菌活性，多用于对细菌感染性疾病的预防和治疗，在畜禽养殖业中扮演着非常重要的角色。磺胺类抗生素的广泛应用，保障了动物的健康，提高了畜禽生产力，促进了畜禽养殖业的发展。但药物在动物性食品中残留，对人类健康和公共卫生产生威胁；畜禽粪便中残留的兽药抗生素进入农田土壤后，不仅造成了土壤的污染，还对整个农业生态环境造成了危害。建立环境介质中磺胺类抗生素的检测分析方法是研究其环境行为和生态环境风险的基础。
[0003]环境中存在的磺胺类抗生素属于痕量物质，发达国家多采用高效液相色谱仪-质谱联用技术进行研究，但该方法成本相对较高，目前对残留兽用磺胺类抗生素的检测研究多在动物性食品领域，在我国的推广使用有一定局限性。
【发明内容】
[0004]为了克服上述现有技术的磺胺类抗生素检测方法成本高、步骤繁琐且多停留在动物性食品检测领域的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法。本发明以高效液相色谱仪为平台，建立了水、土壤及植物样品中残留磺胺类抗生素的检测方法。
[0005]本发明另一目的在于提供上述利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法在检测生态环境残留磺胺类抗生素中的应用。特别是应用于检测水、土壤及植物样品中残留磺胺类抗生素。
[0006]本发明的目的通过下述方案实现:
[0007]—种利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法，包含以下步骤:
[0008](I)对样品进行预处理，得到待检测液。
[0009](2)将待检测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离。
[0010](3)计算分离出的残留磺胺类抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出残留的含量。
[0011]步骤(I)中所述对样品进行预处理，包括以下具体步骤:
[0012]当样品为水样时，将水样通过活化后的HLB小柱进行富集；用甲醇洗脱富集的HLB小柱，甲醇洗脱液旋蒸并吹干后，用ImL甲醇溶解定容，得到待检测液。
[0013]当样品为土壤时，将土壤用提取剂EDTA-Mcllvaine缓冲液:甲醇=3:2 (V:V)进行提取后，提取液过活化后的HLB小柱进行富集；用甲醇洗脱富集的HLB小柱，甲醇洗脱液旋蒸并吹干后，用ImL甲醇溶解定容，得到待检测液。
[0014]当样品为植物时，将植物用甲醇提取并除水后，旋蒸吹干，用HCl溶解旋蒸残渣，得到HCl溶解液，加入乙酸钠缓冲溶液和0.02%的荧光胺丙酮溶液定容，衍生化反应后，得到待检测液；
[0015]所用HCl的浓度为0.lmol/L ；
[0016]所用乙酸钠缓冲溶液为用lmol/L HCl调节pH为3的浓度为0.6mol/L的乙酸钠溶液。
[0017]当样品为植物时，所述定容指每0.5mL HCl溶解液加入0.5mL乙酸钠缓冲溶液和0.2mL0.02%的荧光胺丙酮溶液。
[0018]所述的衍生化反应指18°C水浴反应30min。
[0019]所述的除水指加入无水硫酸钠进行除水。
[0020]步骤(2)中所述将待检测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离，当样品为水样或土壤时，测定的色谱条件为:色谱柱规格为Shim-pack VP-0DS, 150 X 4.6mm, 5 μ m ；SPD-20A紫外检测器，检测波长270nm，柱温40°C，流动相:0.5v/v%乙酸溶液:乙腈:甲醇=75:20:5 (V:V)，流速 1.2mL/min，进样量 20 μ L。
[0021]步骤(2)中所述将待检测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离，当样品为植物时，测定的色谱条件为:色谱柱规格为Shim-pack VP-0DS, 150 X 4.6mm, 5 μ m ；RF-10AXL荧光检测器，检测器波长:激发波长:405nm，发射波长:495nm，流动相:0.5v/v%乙酸溶液:乙腈=60:40 (V:V),柱温 30°C,流速 1.2mL/min,进样量 20 μ L。
[0022]步骤(3)所述标准曲线依照以上步骤(I)至步骤(2)，采用相同的试剂以及参数，在相同实验条件下得出。
[0023]所述磺胺类抗生素指磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SDM')和磺胺喹恶啉(SQ)中的至少一种。
[0024]上述利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法在检测生态环境残留磺胺类抗生素中的应用。
[0025]本发明的机理为:
[0026]本发明利用磺胺类药物在高效液相色谱仪紫外检测器270nm波长下、荧光检测器激发波长405nm,发射波长495nm下检测效果最佳,通过对流动相及各组分配比、流速、温度等条件的优化组合，确定目标药物的最佳检测条件。通过提取方法的优化，确定不同介质中含目标药物样品前处理的最佳方法，建立了水、土壤及植物样品中残留磺胺类抗生素的检测方法。
[0027]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果:
[0028]本发明丰富和完善了环境介质中残留磺胺类抗生素的检测方法；检测效率高，一次可以分离4种磺胺类抗生素；分析物无主要干扰物干扰，基本不影响分析物定性和定量；分析速度快，一次色谱分离过程可在20min内完成，可以满足日常快速定量检测的需求。
【具体实施方式】
[0029]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0030]本发明所提出的高效液相色谱法分离磺胺类抗生素的仪器条件如下:[0031](I)检测器为Sro-20A紫外检测器，检测波长270nm，柱温40°C，流动相:0.5v/v%乙酸溶液:乙腈:甲醇=75:20:5 (V:V)，流速L2mL/min，进样量20yL。
[0032](2) RF-10AXL荧光检测器，检测器波长:激发波长:405nm，发射波长:495nm，流动相:0.5v/v%乙酸溶液:乙腈=60:40 (V: V)，柱温30。。，流速1.2mL/min ;进样量20 μ L0
[0033]实施例1:水和土壤中4种磺胺类抗生素残留的分离检测
[0034](I)所用仪器为日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪，色谱柱规格为Shim-packVP-ODS (150 X 4.6mm，5 μ m)，SH)-20A紫外检测器，检测波长270nm (采用了磺胺类药物的最大吸收波长来测定，以提高灵敏度)，柱温40°C，流动相:0.5v/v%乙酸溶液:乙腈:甲醇=75:20:5 (￥:￥)，流速1.211117111丨11，进样量2(^1^，^: Solution 工作站。
[0035](2)标准曲线的测定:精确称取4种药物，用甲醇溶解配制4种药物浓度均为100 μ g/mL的磺胺混合标准储备液，用流动相稀释，配制4种药物浓度均为0.05,0.10、0.50、1.00、2.00yg/mL的混合标准溶液，采用步骤(1)的条件进行测试，得到工作曲线。4种药物的线性关系、相关系数及检出限见表1。
[0036](3) HLB柱的活化:HLB柱使用前，先后用5mL甲醇、5mL纯水进行活化。
[0037](4)水样的预处理及测试:把4种药物溶于水中得到混合水样，制备两个水样，单个水样中4种药物的浓度相同，一号水样中每种药物的浓度分别为0.5μ g/L，二号水样中每种药物的浓度分别为2 μ g/L。将水样摇晃均匀过滤后，准确量取500mL水样，过活化后的HLB小柱，待柱子干燥30min后，用4mL甲醇洗脱HLB柱，收集洗脱液，于旋转蒸发仪浓缩至近干，再用N2吹干，以ImL甲醇定容待测，按照步骤(1)的条件进行测试，两个水样分别测试。
[0038](5) 土壤样品的预处理及测试:把4种药物混合于土壤(试验用土取自海南省文昌市锦山镇荒废多年的田地，经检测不含目标磺胺类药物)中得到混合土壤样品，制备三个土壤样品，每个土壤样品中4种药物的浓度相同，三个土壤样品中每种药物的浓度分别为0.2 μ g/g、0.5 μ g/g和2 μ g/g。分别称取4g 土壤样品于三角瓶中，加入6mL的提取剂(EDTA-Mcllvaine缓冲液:甲醇=3:2 (V:V)),振荡提取IOmin,超声提取IOmin,离心5min,收集上清液，残渣按此方法反复提取2次，合并3次提取的上清液，将上清液中甲醇旋干，剩余上清液过活化后的HLB柱，待柱子干燥30min后，用4mL甲醇洗脱HLB柱，收集洗脱液，于旋转蒸发仪浓缩至近干，再用N2吹干，以ImL甲醇定容待测，按照步骤(1)的条件进行高效液相色谱分离测试。
[0039](6)对上述测试得到的曲线分析，对分离出的残留磺胺类抗生素面积进行积分，依据标准品制作的标准曲线进行定量计算，得出残留的含量，计算回收率，添加回收率见表2。
[0040]表1紫外检测器下4种磺胺类药物线性关系、相关系数及检出限
[0041]
【权利要求】
1.一种利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法，其特征在于包含以下步骤: (1)对样品进行预处理，得到待检测液； (2)将待检测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离； (3)计算分离出的残留磺胺类抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出残留的含量。
2.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法，其特征在于:步骤(2)中所述将待检测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离，当样品为水样或土壤时，测定的色谱条件为:色谱柱规格为Shim-pack VP-ODS, 150 X 4.6mm, 5 μ m ；SPD-20A紫外检测器，检测波长270nm,柱温40°C，流动相:0.5v/v%乙酸溶液:乙腈:甲醇=75:20:5(V: V)，流速 1.2mL/min，进样量 20 μ L0
3.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法，其特征在于:步骤(2)中所述将待检测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离，当样品为植物时，测定的色谱条件为:色谱柱规格为Shim-pack VP-0DS，150X4.6mm，5ym;RF-10AXL荧光检测器，检测器波长:激发波长:405nm，发射波长:495nm，流动相:0.5v/v%乙酸溶液:乙腈=60:40 (V:V)，柱温 30。。，流速 1.2mL/min，进样量 20 μ L0
4.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法，其特征在于:步骤(I)中所述对样品进行预处理，包括以下具体步骤:当样品为水样时，将水样通过活化后的HLB小柱进行富集；用甲醇洗脱富集的HLB小柱，甲醇洗脱液旋蒸并吹干后，用ImL甲醇溶解定容，得到待检测液。
5.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法，其特征在于:步骤(I)中所述对样品进行预处理，包括以下具体步骤:当样品为土壤时，将土壤用提取剂EDTA-Mcllvaine缓冲液:甲醇=3:2 (V:V)进行提取后，提取液过活化后的HLB小柱进行富集；用甲醇洗脱富集的HLB小柱，甲醇洗脱液旋蒸并吹干后，用ImL甲醇溶解定容，得到待检测液。
6.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法，其特征在于:步骤(I)中所述对样品进行预处理，包括以下具体步骤:当样品为植物时，将植物用甲醇提取并除水后，旋蒸吹干，用HCl溶解旋蒸残渣，得到HCl溶解液，加入乙酸钠缓冲溶液和0.02%的荧光胺丙酮溶液定容，衍生化反应后，得到待检测液。
7.根据权利要求6所述的利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法，其特征在于:所用HCl的浓度为0.lmol/L ;所用乙酸钠缓冲溶液为用lmol/L HCl调节pH为3的浓度为0.6mol/L的乙酸钠溶液。
8.根据权利要求6所述的利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法，其特征在于:所述定容指每0.5mL HCl溶解液加入0.5mL乙酸钠缓冲溶液和0.2mL0.02%的荧光胺丙酮溶液；所述的衍生化反应指18°C水浴反应30min。
9.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法，其特征在于:所述磺胺类抗生素指磺胺甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶和磺胺喹恶啉中的至少一种。
10.根据权利要求1?9任一项所述的利用高效液相色谱快速检测磺胺类抗生素的方法在检测生态环境残留磺胺类抗生素中的应用。
【文档编号】G01N30/02GK103940925SQ201410153267
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】贺德春, 许振成, 吴根义, 马晓蕊, 苏文幸 申请人:环境保护部华南环境科学研究所