对细胞进行原位标记的方法和应用的制作方法

对细胞进行原位标记的方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种对细胞进行原位标记的方法，包括如下步骤：（1）制备含有胆碱类似物的细胞培养液；（2）对细胞进行原位标记。本发明提供的对细胞进行原位标记的方法先采用含有胆碱类似物的细胞培养液培养细胞，然后用报告分子追踪标记在细胞上的胆碱类似物。本发明利用胆碱类似物上标记的叠氮与报告分子上标记的二苯并环丁烯之间的特异性反应对细胞进行原位标记，该方法简单易行，不仅能够快速、高灵敏高分辨率地对细胞膜、细胞器膜上的胆碱类似物进行定位和示踪，而且对细胞毒性低，且对细胞形态、细胞活性以及存活率影响小。此外，本发明提供了一种胆碱类似物在制备细胞原位检测试剂盒中的应用。
【专利说明】对细胞进行原位标记的方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及对细胞进行原位标记的方法和应用。
【背景技术】
[0002]胆碱(Cho)是细胞膜结构和脂蛋白构成上的重要组成部分。在真核生物中，磷脂头端最普遍的基团是胆碱，含磷脂胆碱是细胞膜中最丰富的磷脂，也是细胞膜的主要结构成分，在细胞代谢和信号传导中起着至关重要的作用Adrian Salic课题组利用胆碱在细胞中的代谢途径，通过对胆碱的末端修饰炔基，并用带叠氮的染料通过click铜催化对细胞内胆碱的代谢行为进行示踪分析。然而，在该方法采用的叠氮-炔基Husigen [3+3]环加成反应需要铜作为催化剂，催化剂铜的存在会引起细胞的毒性，因而在活细胞乃至活体的应用中受到很大的限制。
[0003]因此，有必要提供一种对细胞毒性低、影响小的细胞原位示踪方法。

【发明内容】

[0004]为解决上述问题，本发明提供了一种对细胞进行原位标记的方法和应用。
[0005]本发明提供的对细胞进行原位标记的方法采用叠氮修饰的胆碱与报告分子之间反应对细胞进行原位标记，该方法对细胞毒性低，且对细胞形态、细胞活性以及存活率影响小，能够快速、高灵敏高分辨率地对细胞膜上的胆碱类似物进行定位和示踪。
[0006]第一方面，本发明提供了一种对细胞进行原位标记的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0007](I)制备含有胆碱类似物的细胞培养液
[0008]提供不含血清的细胞培养液，加入胆碱类似物至所述胆碱类似物的终浓度为100μΜ~1000 μ Μ，其中，所述胆碱类似物的结构式如Pl所示:
[0009]
【权利要求】
1.一种对细胞进行原位标记的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)制备含有胆碱类似物的细胞培养液 提供不含血清的细胞培养液，加入胆碱类似物至所述胆碱类似物的终浓度为100μΜ~1000 μ Μ，其中，所述胆碱类似物的结构式如Pl所示:
2.如权利要求1所述的对细胞进行原位标记的方法，其特征在于，所述待标记细胞为人类胚肾细胞、人乳腺癌细胞、人肺腺癌细胞或人卵巢癌细胞。
3.如权利要求1所述的对细胞进行原位标记的方法，其特征在于，所述采用不含血清的细胞培养液重悬细胞至细胞终浓度为I X IO5~I X 107/ul。
4.如权利要求1所述的对细胞进行原位标记的方法，其特征在于，所述报告分子与细胞进行孵育的条件为:加入报告分子至所述报告分子的终浓度为100μΜ~ΙΟΟΟμΜ，孵育的时间为10~40分钟。
5.如权利要求1所述的对细胞进行原位标记的方法，其特征在于，所述报告分子与细胞进行孵育后，采用PBS缓冲液洗涤细胞2~4次。
6.如权利要求1所述的对细胞进行原位标记的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对所述染料分子为荧光素、罗丹明、菁染料分子、二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类或芘类。
7.如权利要求6所述的对细胞进行原位标记的方法，其特征在于，所述荧光素为异硫氰酸荧光素、羟基荧光素或四氯荧光素。
8.如权利要求6所述的对细胞进行原位标记的方法，其特征在于，所述罗丹明为罗丹明101、四乙基罗丹明或羧基四甲基罗丹明。
9.如权利要求6所述的对细胞进行原位标记的方法，其特征在于，所述菁染料分子为噻唑橙、噁唑橙、或多甲川系列菁染料。
10.如权利要求1所述的胆碱类似物在制备细胞原位检测试剂盒中的应用，其中，所述细胞为人类胚肾细胞、人乳腺癌细胞、人肺腺癌细胞或人卵巢癌细胞，所述胆碱类似的结构式如Pl所示:
【文档编号】G01N33/52GK103983764SQ201410154914
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月17日 优先权日:2014年4月17日
【发明者】蔡林涛, 刘宏, 潘正银, 张鹏飞, 李文军, 潘宏, 马轶凡 申请人:深圳先进技术研究院