基于m13噬菌体检测赭曲霉毒素a的免疫层析试纸及制备方法
【专利摘要】本发明公开一种基于M13噬菌体快速检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸及制备方法，试纸吸附层包括吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和吸水材料层，纤维素膜层上设有用展示OTA模拟表位的M13噬菌体印制的检测印迹以及用羊抗小鼠IgG抗体溶液的对照印迹；金标抗体为胶体金标记的OTA单克隆抗体或多克隆抗体。本发明实现了基于M13噬菌体的免疫层析技术在快速检测OTA残留中的应用，用展示有OTA模拟表位的M13噬菌体取代了传统试纸条检测印记上印制的OTA偶联物，避免了OTA偶联物对于试纸生产者、实验人员和环境的危害；该试纸检测的特异性强、灵敏度高，检测简便、直观、准确，成本低，适用范围广。
【专利说明】基于M13噬菌体检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种免疫层析试纸，特别是涉及一种以展示有OTA模拟表位的M13噬菌体作为检测印记，用于快速检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸及其制备方法。
[0002]【背景技术】
赭曲霉毒素(Ochratoxin)是曲霉属和青霉属的某些菌株产生的次级代谢产物，它包含七种结构类似的化合物，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农作物污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A (Ochratoxin Α，0ΤΑ)，其作用的靶器官主要是肾脏和肝脏，是一种强烈的肾、肝毒素，并具有较强的致癌、致畸和致突变作用。由于OTA广泛存在于农产品及畜产品，且能经食物链进入人体，对人类生命健康造成危害，因此，如何实现对OTA的快速、准确检测意义重大。
[0003]目前，对OTA检测方法有化学分析法、仪器分析法和免疫学分析法等。其中免疫学分析法以敏感度高、检出限低的优势在OTA定性、定量检测中广泛应用，实现了 OTA快速、简便、高灵敏检测，对保障我国农产品安全有着积极意义。但是，免疫学检测方法是建立在以标记毒素或偶联毒素为竞争抗原基础上的有毒检测体系，存在毒素标品昂贵，对生产及操作人员的健康有害，以及偶联反应重复性差等缺陷，制约了它的应用和推广。
[0004]近年来，利用噬菌体随机肽库技术得到的模拟表位肽替代毒素作为竞争抗原，建立的无毒检测体系，推动了 OTA免疫学检测的快速发展。噬菌体随机肽库技术是以大量随机编码的多肽序列插入噬菌体展示载体，形成噬菌体展示文库。每个噬菌体粒子或者噬菌体只展示一种序列的外源肽链，不同的噬菌体粒子或者噬菌体展示不同序列的外源肽链。
[0005]免疫试纸法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度高，分析过程简单，用作OTA的检测有独特优势，是需要优先发展的检测技术。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题:针对现有技术存在的不足，提供一种安全、特异、灵敏、简便、快速检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸及其制备方法。
[0007]本发明的技术方案:
一种基于M13噬菌体检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸，包括底层的支撑层、中间层的吸附层和固定在吸附层上的保护层，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用展示OTA模拟表位的M13噬菌体印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述金标抗体纤维层采用吸附金标抗体的玻璃纤维棉制成，金标抗体采用胶体金纳米颗粒标记的OTA的单克隆抗体或多克隆抗体。
[0008]所述OTA模拟表位的多肽序列为MPLWXDL，X为任意氨基酸。
[0009]所述Ml3噬菌体由以下方法筛选，具体步骤为:
(I)亲和筛选M13噬菌体随机七肽库 取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，每孔加入稀释后的噬菌体肽库100 μ L，其中含噬菌体IX IO11?2 X IO11Pfu,室温下轻摇震荡lh，弃去液体；沉淀用TBST溶液洗涤10次，洗去未结合的噬菌体后，每孔加入100 μ L ρΗ2.2的洗脱液Gly-HCl，室温下轻摇震荡8min，吸出洗脱液，加入中和缓冲液至中性；中和后的洗脱液除留一部分作滴度测定外，其余的洗脱液接种处于对数生长前期的E.coli ER2738的LB培养液中，进行扩增培养；于37°C震荡培养4-5h，4°C、12000rpm离心lOmin，向上清液中加入占上清液1/6体积的PEG/NaCl溶液，4°C沉淀过夜；沉淀后，4°C、12000rpm离心15min，弃上清，再用TBST溶液悬浮噬菌体，加入占TBST溶液1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育60min ;再4°C离心15min，去上清，沉淀用TBST溶液悬浮；
测定滴度后，进行第2次、第3次和第4次亲和筛选；每次加入噬菌体的量为I X IO11?2 X 10npfu，包被的抗体量分别为75,50和25 μ g/ml ;TBST溶液中Tween-20的含量从第2次筛选起增至0.5%，其余步骤与第I轮筛选相同，第4次筛选后的洗脱产物经滴度测定后，从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选若干蓝色噬菌斑，分别接种处于对数生长期前期的疋coli ER2738的LB培养液中进行扩增培养，纯化并测定滴度；
(2)鉴定噬菌体克隆
取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，加入要鉴定的噬菌体克隆，37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13的单克隆抗体，37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加入2mol/L的H2SO4终止反应，测定在450nm波长下的吸光度OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值>空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性；
然后采取竞争ELISA方法鉴定阳性噬菌体克隆的敏感性，加入不同浓度的OTA稀释液和阳性噬菌体，于37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加2mol/L的H2SO4终止反应，测定在450nm波长下的吸光度OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值>空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性；计算各浓度下噬菌体的结合率，并作标准曲线判断噬菌体克隆的敏感性；
(3)DNA测序及多肽序列分析
将扩增后的噬菌体进行测序，根据插入的DNA序列翻译出氨基酸序列，采用的-96 g III测序引物为Y - hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3、模拟表位的氨基酸序列为MPLWXDL，X为任意氨基酸。
[0010]所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。
[0011]所述隐形检测印迹和隐形对照印迹为平行排列的“ I I ”直线式印迹、“十十”字型排列印迹、
“丁 丁”字型排列印迹、“丄丄”字型排列印迹、“ h P，字型排列印迹或“~1 H，，字型排列印迹。
[0012]所述保护层为覆盖在吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上的保护膜，在吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向吸附纤维层一侧0.3-0.7cm。[0013]所述PEG/NaCl 溶液中 PEG-8000 的浓度为 20% (w/v)，NaCl 的浓度为 2.5mol/L。
[0014]一种免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤:
(1)OTA单克隆抗体或多克隆抗体的制备；
(2)M13噬菌体的筛选；
(3)金标抗体的制备:在沸腾的0.01~0.02% (w/v)氯金酸水溶液中加入1% (w/v)新配制的柠檬酸钠溶液，反应后获得直径15~20nm的胶体金溶液，用0.lmol/L的K2CO3调节pH值至8.5^9.5，置于2~8°C保存备用；
以1:2000的标记比将待标记的OTA单克隆抗体或多克隆抗体加入pH 8.5、.5的胶体金溶液中，标记IOmin后加入20% (w/v)的PEG10000至终浓度为0.05%,于4°C、1500~3000rpm离 心20min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C、15000rpm离心lh,弃上清,获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析，经分离纯化后获得胶体金标记的OTA抗体；
(4)吸附纤维层的制备:吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；
(5)纤维素膜层的制备:纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成，用点样仪在纤维素膜上不同位置分别喷点检测印迹和对照印迹，然后烘干；
(6)试纸的组装:将吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从左至右依次贴在涂有粘合剂的支撑层上，依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸。
[0015]所述M13噬菌体的筛选是按以下方法进行的:
(1)亲和筛选M13噬菌体随机七肽库
取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，每孔加入稀释后的噬菌体肽库100 μ L，其中含噬菌体IX IO11~2 X IO11Pfu,室温下轻摇震荡lh，弃去液体；沉淀用TBST溶液洗涤10次，洗去未结合的噬菌体后，每孔加入100 μ L ρΗ2.2的洗脱液Gly-HCl，室温下轻摇震荡8min，吸出洗脱液，加入中和缓冲液至中性；中和后的洗脱液除留一部分作滴度测定外，其余的洗脱液接种处于对数生长前期的E.coli ER2738的LB培养液中，进行扩增培养；于37°C震荡培养4-5h，4°C、12000rpm离心10min，向上清液中加入占上清液1/6体积的PEG/NaCl溶液，4°C沉淀过夜；沉淀后，4°C、12000rpm离心15min，弃上清，再用TBST溶液悬浮噬菌体，加入占TBST溶液1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育60min ;再4°C离心15min，去上清，沉淀用TBST溶液悬浮；
测定滴度后，进行第2次、第3次和第4次亲和筛选；每次加入噬菌体的量为I X IO11~2 X 10npfu，包被的抗体量分别为75,50和25 μ g/ml ;TBST溶液中Tween-20的含量从第2次筛选起增至0.5%，其余步骤与第I轮筛选相同，第4次筛选后的洗脱产物经滴度测定后，从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选若干蓝色噬菌斑，分别接种处于对数生长期前期的疋coli ER2738的LB培养液中进行扩增培养，纯化并测定滴度；
(2)鉴定噬菌体克隆
取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，加入要鉴定的噬菌体克隆，37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13的单克隆抗体，37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加入2mol/L的H2SO4终止反应，测定在450nm波长下的吸光度OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值>空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性；
然后采取竞争ELISA方法鉴定阳性噬菌体克隆的敏感性，加入不同浓度的OTA稀释液和阳性噬菌体，于37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加2mol/L的H2SO4终止反应，测定在450nm波长下的吸光度OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值>空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性；计算各浓度下噬菌体的结合率，并作标准曲线判断噬菌体克隆的敏感性；
(3)DNA测序及多肽序列分析
将扩增后的噬菌体进行测序，根据插入的DNA序列翻译出氨基酸序列，采用的-96 g III测序引物为Y - hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3、模拟表位的氨基酸序列为MPLWXDL，X为任意氨基酸。
[0016]本发明的积极有益效果:
(I)本发明实现了基于M13噬菌体的免疫层析技术在快速检测OTA残留中的应用，该试纸最大特点在于其用展示有OTA模拟表位的M13噬菌体取代了传统试纸检测印记上印制的OTA偶联物，避免了 OTA偶联物对于试纸生产者、实验人员和环境的危害。
[0017]本发明中M13噬菌体的筛选以抗OTA的单克隆抗体为配基，从噬菌体随机七肽库中亲和筛选OTA的模拟表位，并利用展示有OTA模拟表位的M13噬菌体替代人工合成抗原。
[0018](2)特异性强，灵敏度高。本发明试纸以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体或多克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的特异性及亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，该试纸具有较强的特异性和较高的灵敏度，可检测到5ng/ml的微量赭曲霉毒素A0
[0019](3)安全性好。该试纸中展示有OTA模拟表位的M13噬菌体具有无毒无害的特点，使得基于M13噬菌体组装的试纸对于试纸生产者、检测者和环境均无任何危害，安全。
[0020](4)简便、快速。使用本发明试纸，无需其他任何试剂和仪器，可现场操作。只需将试纸插入被检样品中10-20秒，取出后5分钟内即可判定检测结果。
[0021](5)结果显示形象、直观、准确。本发明试纸以显示红色“ I ”和“ I I ”(或“十”、“丁”、“_L”、“”)印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条红色“ I ”印迹，表示被检样品中含有0ΤΑ;显示两条红色“ I I ”印迹，表示被检样品中不含0ΤΑ。此结果可用肉眼直接观测，判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。
[0022](6)节省费用。使用该试纸无需另配仪器和其他试剂，可随时随地进行检测，费用低廉，能节省大量贵重仪器及设备费用。
[0023](7)适用范围广，便于推广应用。本发明实现了基于M13噬菌体的免疫层析技术在快速检测OTA中的应用，使OTA的检测无本底干扰；操作简便，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加工、养殖户以及消费者个人等。本发明在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要的意义，将具有明显的经济效益和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】[0024]图1为本发明的免疫层析试纸的结构示意图。
[0025]图2为图1中免疫层析试纸的俯视结构示意图。
[0026]图中，I为支撑层，2为吸附纤维层，3为金标抗体纤维层，4为纤维素膜层，5为吸水材料层，6为隐形检测印记，7为隐形对照印记，8-1为测试端保护膜，8-2为手柄端保护膜，9为样品标记线。
【具体实施方式】
[0027]本发明试纸的制备过程包括:0ΤΑ单克隆或多克隆抗体的制备、展示有OTA模拟表位的M13曬菌体的筛选、金标抗体纤 维层的制备、吸附纤维层的制备、纤维素膜层的制备和试纸的组装等步骤。
[0028]1、OTA单克隆抗体或多克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备:包括OTA人工抗原的制备、免疫动物(小鼠)、细胞融合、单克隆抗体的筛选、单克隆抗体的制备；多克隆抗体的制备:包括OTA人工抗原的制备、免疫动物(白兔)、多克隆抗体的筛选和多克隆抗体的制备。
[0029]( I) OTA人工抗原的制备
取Img OTA溶解于乙醇中，加入3mg DCC和2mg NHS，4°C避光搅拌反应12h，1000Orpm离心15min，弃沉淀，干燥上清液，将干燥产物溶解于二甲基亚砜中，得到活化产物；称取IOmg BSA,充分溶解于0.13mol/L的NaHCO3溶液中，于4°C预冷；将活化产物逐滴缓慢加入预冷到4°C的BSA溶液中，4°C避光剧烈震荡4h，产物在PBS中透析72h，5000rpm离心10min，取上清为免疫抗原OTA-BSA，分装，_20°C保存备用。同法制备包被原。
[0030](2) OTA单克隆抗体的制备
用制得的OTA人工抗原以5(^g /只的用量免疫6~8周龄BALB/c小鼠3~4次，每次免疫间隔3~4周，确定抗体效价符合要求后超强免疫，之后3~4天将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用75%的酒精浸泡小鼠5~IOmin消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000rpm离心10min，收集脾细胞。将IX IO8的脾细胞与NSO骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，1000rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀物于37°C水浴中，缓缓加入0.7~1.0mL 50%的PEG4000作用lmin，然后缓缓加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用；37°C水浴5~10 min，1000rpm离心10min，弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板孔(100μL~200μL7孔)，置于37°C、5%C02培养箱中培养10~14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可特异地与OTA反应，亲和力常数达到101°~1012，亚型为IgG1,用于制备金标抗体玻璃纤维棉。
[0031](3) OTA多克隆抗体的制备
用制得的OTA人工抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为200μ8~500μ8/次，背部皮下分
4~6点注射。免疫4~5次，每次免疫间隔2~3周，最后一次免疫后10~15天以ELISA法测定效价，并鉴定其敏感性和特异性，采血并分离收集血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，即取1份血清加2份PBS (ρΗ7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4°C冰箱12h，4°C、2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS (pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度为33%，置4°C冰箱2h，4°C、2500rpm离心15min，弃上清，以适量PBS (pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱内用PBS (pH7.2)透析48~72h，中间换液数次，4°C、12000rpm离心15min,收集上清，得纯化的抗OTA多克隆抗体，_20°C冻存，用于制备金标抗体玻璃纤维棉。
[0032]2、展示有OTA模拟表位的M13噬菌体的筛选
(1)亲和筛选M13噬菌体随机七肽库
取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，每孔加入稀释后的噬菌体肽库100 μ L，其中约含噬菌体IX IO11~2 X IO11Pfu,室温下轻摇震荡lh，弃去液体；沉淀用TBST溶液洗涤10次，洗去未结合的噬菌体后，每孔加入100 μ L ρΗ2.2的洗脱液Gly-HCl，室温下轻摇震荡8min，吸出洗脱液，加入中和缓冲液至中性；中和后的洗脱液除留一部分作滴度测定外，其余的洗脱液接种处于对数生长前期的E.coli ER2738的LB培养液中，进行扩增培养；于37°C震荡培养4-5h，4°C、12000rpm离心10min，向上清液中加入占上清液1/6体积的PEG/NaCl溶液，4°C沉淀过夜；沉淀后，4°C、12000rpm离心15min，弃上清，再用TBST溶液悬浮噬菌体，加入占TBST溶液1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育60min ;再4°C离心15min，去上清，沉淀用TBST溶液悬浮；
测定滴度后，进行第2次、第3次和第4次亲和筛选；每次加入噬菌体的量为
1X IO11~2 X 10npfu，包被的抗体量分别为75,50和25 μ g/ml ;TBST溶液中Tween-20的含量从第2次筛选起增至0.5%，其余步骤与第I轮筛选相同，第4次筛选后的洗脱产物经滴度测定后，从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选若干蓝色噬菌斑，分别接种处于对数生长期前期的疋coli ER2738的LB培养液中进行扩增培养，纯化并测定滴度；
(2)鉴定噬菌体克隆
取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，加入要鉴定的噬菌体克隆，37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13的单克隆抗体，37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加入2mol/L的H2SO4终止反应，测定在450nm波长下的吸光度OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值>空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性；
然后采取竞争ELISA方法鉴定阳性噬菌体克隆的敏感性，加入不同浓度的OTA稀释液和阳性噬菌体，于37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加2mol/L的H2SO4终止反应，测定在450nm波长下的吸光度OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值>空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性；计算各浓度下噬菌体的结合率，并作标准曲线判断噬菌体克隆的敏感性；
(3)DNA测序及多肽序列分析
将扩增后的噬菌体进行测序，根据插入的DNA序列翻译出氨基酸序列，采用的-96 g III测序引物为Y - hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3、模拟表位的氨基酸序列为MPLWXDL，X为任意氨基酸。
[0033]3、金标抗体纤维层的制备
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液。即在沸腾的0.01-0.02%(w/v)氯金酸水溶液中加入l%(w/v)新配制的柠檬酸钠溶液，反应后获得直径15~20nm的胶体金溶液，用0.1mol/L的K2CO3调节pH值至8.5^9.5，置于2~8°C保存备用。
[0034]以1:2000的标记比将待标记的OTA单克隆抗体或多克隆抗体加入pH 8.5^9.5的胶体金溶液中，标记IOmin后，加入20% (w/v)的PEG10000至终浓度为0.05%，4°C、1500~3000rpm离心20min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C、15000rpm离心lh,弃上清,获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化后获得胶体金标记的OTA抗体。将l:10(Tl:500稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维绵中，4°C低温真空干燥，制备金标抗体玻璃纤维棉。
[0035]4、吸附纤维层的制备
测试端吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜或聚酯膜制备，将纤维材料剪成宽1.5cm规格的条带，将其放入样品垫封闭液中浸泡30min，于37°C烘干，备用。
5、纤维素膜层的制备
纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成，剪切成宽1.5cm规格的条带，用点样仪在纤维素膜上不同位置分别喷点展示有OTA模拟表位的M13噬菌体和羊抗小鼠IgG抗体(或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG抗体)，制作隐形的检测印迹带和对照印迹带，于37 °C烘干备用。
[0036]其中羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体的制备方法如下:
以饱和硫酸铵提取OTA阴性小鼠血清IgG (或阴性兔血清IgG)，取1份小鼠血清(或兔血清)，加2份PBS (pH7.2)混匀，加等体积的饱和硫酸铵溶液混匀，置4°C冰箱12h，4°C、2500rpm离心15min，弃上清；再以适量PBS (pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度为33%，置41:冰箱211，41:、2500印111离心15min，弃上清；以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱内，用PBS (ρΗ7.2)透析48h，中间换液3次，4°C、12000rpm离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度；以5(^g~lOOPg/kg体重的小鼠血清(或兔血清)IgG经皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3~4次，末次注射10天后，以ELISA测定其血清效价达到1:2000以上时，心脏或动脉采血，分离收集高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体(方法与提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于OTA检测试纸对照印迹的制备。
[0037]6、免疫层析试纸的组装
将吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从左至右依次贴在带有粘合剂的支撑层上，并切成3-4cm宽的试纸。
[0038]7、免疫层析试纸的检测反应原理
当试纸测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测OTA及金标抗体纤维层中的金标抗体一起向纤维素膜层扩散，并最终渗入手柄端的吸水材料层。在扩散过程中，待测OTA可与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上OTA的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜上展示有OTA模拟表位的M13噬菌体的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而羊或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体则可与金标抗体结合，形成红色对照印迹带“ I ”，即一条红色带印迹为阳性表示；反之样品溶液中无OTA时，则不能阻止金标抗体与纤维素膜上的展示有OTA模拟表位的M13噬菌体的检测印迹结合，显示红色检测印迹带，同样羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体也与金标抗体结合，显示红色对照印迹带“ I ”，形成两条红色带“ I I”为阴性表示。如果纤维素膜上没有任何红色印迹带显示，则表明试纸已失效。
[0039]以下通过实施例具体说明本发明试纸的结构。[0040]实施例一:基于M13噬菌体快速检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸，参见图1、图
2。图中I为支撑层，用塑胶薄片条制成，2为吸附纤维层，用玻璃纤维棉制成，金标抗体纤维层3上吸附有抗OTA单克隆抗体的金标抗体玻璃纤维棉，纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜，手柄端的吸水材料层5用吸水滤纸制成，将吸附纤维层2、金标抗体纤维层3、纤维素膜层4、吸水材料层5各层从左至右依次粘贴固定在支撑层I上，彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层4上设有隐形检测印迹6，隐形检测印迹用展示有OTA模拟表位的M13噬菌体制成；隐形对照印迹7用羊抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜上印迹制成，两条印迹带平行排列，形成组合印迹带“ I I”。
[0041]8-1为覆盖在吸附纤维层2和金标抗体纤维层3上面的样品端保护膜(白色)，8_2为手柄端保护膜，覆盖在吸水材料层5上面，为其它颜色(如黄色)，9为样品标记线，该标记线位于吸附纤维层2与金标抗体纤维层3交界处对应的白色保护膜偏向吸附纤维层2 —侧约0.5cm处,在标记线右侧保护膜上印有箭头及Max字样。
[0042]待测样品的制备及检测步骤:
检测玉米:将样品碾碎、磨细，称取5g样品，用12.5ml 70%的甲醇-PBS溶液溶解，剧烈震荡5分钟，将提取液用whatman I号滤纸进行过滤后，取Iml滤液加入Iml PBS中，待用。
[0043]操作方法:将OTA试纸样品端插入待测样品中，插入深度不超过标记线，约10?20秒取出试纸，水平放置，5min内观察判定检测结果。
[0044]结果判定:(a)阳性如果在纤维素膜上显示有一条红色印迹带“ I ”，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有OTA; (b)阴性如果在纤维素膜上显示有两条红色印迹带“ I I ”，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含OTA; (C)失效如果在纤维素膜上没有红色带显示，则表明试纸已失效。
[0045]实施例二:试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于:金标抗体纤维层3吸附有抗OTA的多克隆抗体，吸附纤维层2用尼龙膜制成，纤维素膜层4采用纯纤维素膜，隐形检测印迹带和隐形对照印迹带均为“十”，手柄端保护膜8-2为兰色。
检测面粉:样品制备方法同实施例一。
[0046]结果判定:(a)阳性如果在纤维素膜上显示有一条红色印迹带“十”，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有OTA; (b)阴性如果在纤维素膜上显示有两条红色印迹带“十”，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含OTA; (c)失效如果在纤维素膜上没有红色带显示，则表明试纸已失效。操作方法同实施例一。
[0047]实施例三:试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于:吸附纤维层2用聚偏二氟乙烯PVDF膜制成，隐形对照印迹7用兔抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜上制成，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜，手柄端保护膜8-2为绿色，隐形检测印迹带和隐形对照印迹带均为“丁'
[0048]检测饲料:样品制备方法、结果判定和操作方法均同实施例一。
[0049]实施例四:试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于:吸附纤维层2用聚酯膜制成，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜，检测印迹带和对照印迹带均为“I”。操作方法和结果判定方法同例一。
[0050]实施例五:试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于:吸附纤维层2用尼龙膜制成，隐形对照印迹7用羊抗兔IgG抗体溶液在纤维素膜上制成。检测印迹带和对照印迹带均为“ P’。检测样品、结果判定和操作方法同例一。
[0051]实施例六:和实施例一基本相同，不同之处在于:金标抗体纤维层3吸附有抗OTA的多克隆抗体，检测印迹带和对照印迹带均为”。
【权利要求】
1.一种基于M13噬菌体检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸，包括底层的支撑层、中间层的吸附层和固定在吸附层上的保护层，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其特征在于:在纤维素膜层上设有用展示OTA模拟表位的M13噬菌体印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述金标抗体纤维层采用吸附金标抗体的玻璃纤维棉制成，金标抗体采用胶体金纳米颗粒标记的OTA的单克隆抗体或多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于:所述OTA模拟表位的多肽序列为MPLWXDL，X为任意氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的免疫层析试纸，其特征在于:所述M13噬菌体由以下方法筛选，具体步骤为: (1)亲和筛选M13噬菌体随机七肽库 取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，每孔加入稀释后的噬菌体肽库100 μ L，其中含噬菌体1X 1O11~2 X IO11Pfu,室温下轻摇震荡lh，弃去液体；沉淀用TBST溶液洗涤10次，洗去未结合的噬菌体后 ，每孔加入100 μ L ρΗ2.2的洗脱液Gly-HCl，室温下轻摇震荡8min，吸出洗脱液，加入中和缓冲液至中性；中和后的洗脱液除留一部分作滴度测定外，其余的洗脱液接种处于对数生长前期的E.coli ER2738的LB培养液中，进行扩增培养；于37°C震荡培养4-5h，4°C、12000rpm离心10min，向上清液中加入占上清液1/6体积的PEG/NaCl溶液，.4°C沉淀过夜；沉淀后，4°C、12000rpm离心15min，弃上清，再用TBST溶液悬浮噬菌体，加入占TBST溶液1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育60min ;再4°C离心15min，去上清，沉淀用TBST溶液悬浮； 测定滴度后，进行第2次、第3次和第4次亲和筛选；每次加入噬菌体的量为.1 X 1O11~2 X 10npfu，包被的抗体量分别为75,50和25 μ g/ml ;TBST溶液中Tween-20的含量从第2次筛选起增至0.5%，其余步骤与第I轮筛选相同，第4次筛选后的洗脱产物经滴度测定后，从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选若干蓝色噬菌斑，分别接种处于对数生长期前期的疋coli ER2738的LB培养液中进行扩增培养，纯化并测定滴度； (2)鉴定噬菌体克隆 取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，加入要鉴定的噬菌体克隆，37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13的单克隆抗体，37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加入2mol/L的H2SO4终止反应，测定在450nm波长下的吸光度.OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值>空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性； 然后采取竞争ELISA方法鉴定阳性噬菌体克隆的敏感性，加入不同浓度的OTA稀释液和阳性噬菌体，于37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加2mol/L的H2SO4终止反应，测定在450nm波长下的吸光度OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值>空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性；计算各浓度下噬菌体的结合率，并作标准曲线判断噬菌体克隆的敏感性； (3)DNA测序及多肽序列分析 将扩增后的噬菌体进行测序，根据插入的DNA序列翻译出氨基酸序列，采用的-.96 g III测序引物为Y - hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3、模拟表位的氨基酸序列为MPLWXDL, X为任意氨基酸。
4.根据权利要求1-3任一项所述的免疫层析试纸，其特征是:所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。
5.根据权利要求1-3任一项所述的免疫层析试纸，其特征是:所述隐形检测印迹和隐形对照印迹为平行排列的“ I I ”直线式印迹、“十十”字型排列印迹、 “丁丁”字型排列印迹、“丄I”字型排列印迹、“ h P’字型排列印迹或“~1 H ”字型排列印迹。
6.根据权利要求1-3任一项所述的免疫层析试纸，其特征是:所述保护层为覆盖在吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上的保护膜，在吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向吸附纤维层一侧0.3-0.7cm。
7.根据权利要求3所述的免疫层析试纸，其特征是:所述PEG/NaCl溶液中PEG-8000的浓度为20%(w/v)，NaCl的浓度为2.5mol/L。
8.—种权利要求1所述免疫层析试纸的制备方法，其特征是:该方法包括以下步骤: (1)OTA单克隆抗体或多克隆抗体的制备； (2)M13噬菌体的筛选； (3)金标抗体的制备:在沸腾的0.01~0.02% (w/v)氯金酸水溶液中加入1% (w/v)新配制的柠檬酸钠溶液，反应后获得直径15~20nm的胶体金溶液，用0.lmol/L的K2CO3调节pH值至8.5^9.5，置于2~8°C保存备用； 以1:2000的标记比将待标记的OTA单克隆抗体或多克隆抗体加入pH 8.5、.5的胶体金溶液中，标记IOmin后加入20% (w/v)的PEG10000至终浓度为0.05%,于4°C、1500~3000rpm离心20min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C、15000rpm离心lh,弃上清,获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析，经分离纯化后获得胶体金标记的OTA抗体； (4)吸附纤维层的制备:吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成； (5)纤维素膜层的制备:纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成，用点样仪在纤维素膜上不同位置分别喷点检测印迹和对照印迹，然后烘干； (6)试纸的组装:将吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从左至右依次贴在涂有粘合剂的支撑层上，依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征是:所述M13噬菌体的筛选是按以下方法进行的: (I)亲和筛选M13噬菌体随机七肽库 取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，每孔加入稀释后的噬菌体肽库100 μ L，其中含噬菌体IX IO11~2 X IO11Pfu,室温下轻摇震荡lh，弃去液体；沉淀用TBST溶液洗涤10次，洗去未结合的噬菌体后，每孔加入100 μ L ρΗ2.2的洗脱液Gly-HCl，室温下轻摇震荡8min，吸出洗脱液，加入中和缓冲液至中性；中和后的洗脱液除留一部分作滴度测定外，其余的洗脱液接种处于对数生长前期的E.coli ER2738的LB培养液中，进行扩增培养；于37°C震荡培养4-5h，4°C、12000rpm离心10min，向上清液中加入占上清液1/6体积的PEG/NaCl溶液，.4°C沉淀过夜；沉淀后，4°C、12000rpm离心15min，弃上清，再用TBST溶液悬浮噬菌体，加入占TBST溶液1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育60min ;再4°C离心15min，去上清，沉淀用TBST溶液悬浮； 测定滴度后，进行第2次、第3次和第4次亲和筛选；每次加入噬菌体的量为I X IO11~2 X 10npfu，包被的抗体量分别为75,50和25 μ g/ml ;TBST溶液中Tween-20的含量从第2次筛选起增至0.5%，其余步骤与第I轮筛选相同，第4次筛选后的洗脱产物经滴度测定后，从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选若干蓝色噬菌斑，分别接种处于对数生长期前期的疋coli ER2738的LB培养液中进行扩增培养，纯化并测定滴度； (2)鉴定噬菌体克隆 取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，加入要鉴定的噬菌体克隆，37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13的单克隆抗体，37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加入2mol/L的H2SO4终止反应，测定在450nm波长下的吸光度.OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值>空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性； 然后采取竞争ELISA方法鉴定阳性噬菌体克隆的敏感性，加入不同浓度的OTA稀释液和阳性噬菌体，于37°C作用lh，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加2mol/L的H2SO4终止反应，测定在450nm波长下的吸光度OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值>空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性；计算各浓度下噬菌体的结合率，并作标准曲线判断噬菌体克隆的敏感性； (3)DNA测序及多肽序列分析 将扩增后的噬菌体进行测序，根据插入的DNA序列翻译出氨基酸序列，采用的-.96 g III测序引物为Y - hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3、模拟表位的氨基酸序列为MPLWXDL，X为任意氨基酸。
【文档编号】G01N33/68GK103969444SQ201410174931
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】胡骁飞, 张改平, 邢广旭, 王耀, 王方雨, 赵东, 邓瑞广 申请人:河南省农业科学院