一种基于cid与etd质谱谱图融合的多肽从头测序方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于CID与ETD质谱谱图融合的多肽从头测序方法，该方法包括以下步骤：1)对多肽进行N-末端正电荷衍生；2)对步骤1)所得衍生多肽分别进行CID质谱裂解与ETD质谱裂解；3)将步骤2)所得CID谱图与ETD谱图融合，得到CID-ETD融合谱图；4)对CID-ETD融合谱图进行解析。本发明还提供了所述方法在多肽从头测序中的应用。本发明的提供的多肽从头测序方法克服了单一的CID或ETD谱图无法提供完整多肽碎裂信息的缺陷，可以得到高可信度的多肽从头测序结果。
【专利说明】一种基于CID与ETD质谱谱图融合的多肽从头测序方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及多肽分析领域，具体地，涉及一种多肽从头测序方法，该方法通过将同一多肽段的CID谱图与ETD谱图相融合来解析多肽序列。
【背景技术】
[0002]在质谱(Mass Spectrometry, MS)技术中，串联质谱(MS/MS)可用于获得目标物质结构的碎片，从而对目标物质进行结构分析。目前，通过液相色谱-串联质谱联用系统(LC-MS/MS)可以很容易地分离与裂解复杂的多肽混合物，从而进行蛋白质的结构分析。
[0003]数据库检索法是使用串联质谱进行蛋白质结构分析时的常规方法。该方法是从特定的蛋白质数据库中提取目标物质所有的肽段序列，并将它们与串联质谱所得谱图进行比较和打分，找到可能性最大的肽段序列。但是，对于基因组未测序的物质，由于无法建立相应的蛋白质数据库，常规的数据库检索方法无法获得可以与质谱谱图进行比较分析的多肽序列。
[0004]多肽从头测序技术通过串联质谱谱图上碎片离子之间的质量差得到对应的氨基酸残基，可得到所有物种的肽段序列及翻译后修饰，无需借助蛋白质数据库进行检索和比较即可对多肽序列进行鉴定。多肽从头测序有着很大的发展潜力，但是目前低可信度的鉴定结果限制了该技术的广泛应用。这种低可信度主要是由不充分的裂解以及同时产生的N-端系列离子和C-端系列离子相互重叠导致的。其中，N-端系列离子为a系列、b系列或c系列离子，C-端系列离子为X系列、y系列或z系列离子。
[0005]目前，为了避免N-端与C-端系列离子的重叠，提高多肽从头测序的可信度，可采用多肽N-末端衍生技术进行图谱简化处理。该技术包括多肽N-末端的负电荷衍生与正电荷衍生。其中，多肽N-末端正电荷衍生是指在多肽N-末端引入一个季铵基团或季膦基团，从而提高二级谱图中多肽N-末端a、b或c系列碎片离子的信号强度。(琥珀酰亚胺氧基羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化磷(Succinimidyloxycarbonylmethyltris(2, 4, 6-trimethoxyphenyl)phosphonium bromide, TMPP-Ac-OSu)是一种重要的多妝N-端正电荷衍生试剂，它可在一个简单、快速、温和的条件下对多肽的N-端进行特异性的衍生，得到二价的TMPP-Ac衍生多肽。
[0006]碰撞诱导裂解(Collis1nInduced Dissociat1n, CID)与电子转移裂解(Electron Transfer Dissociat1n,ETD)是质谱的两种不同裂解方式。二价的ΤΜΡΡ-Ac衍生多肽可以产生简化的CID谱图，图中主要以一价b离子为主；二价的TMPP-Ac衍生多肽可以产生简化的ETD谱图，图中只包含一价c离子和几个已知的背景离子。大多数情况下，CID谱图含有不完整的一价b系列离子，ETD谱图含有不完整的一价c系列离子，同一多肽单独的CID谱图或ETD谱图都无法提供充分的碎裂信息对多肽的序列进行从头鉴定。
[0007]同一多肽的CID谱图与ETD谱图提供的信息具有互补性，二者可以相互结合得到完整的多肽碎片信息。目前，尚无通过将同一多肽段的CID谱图与ETD谱图相融合的方法进行多肽从头测序的报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种多肽从头测序方法，以克服单一的CID或ETD谱图无法提供完整多肽碎裂信息的弊病，得到高可信度多肽从头测序结果。
[0009]本发明提供了一种多肽从头测序方法，该方法包括以下步骤:
[0010]I)对多肽进行N-末端正电荷衍生；
[0011]2)对步骤I)所得衍生多肽进行CID质谱裂解与ETD质谱裂解；
[0012]3)将步骤2)所得CID谱图与ETD谱图融合，得到CID-ETD融合谱图；
[0013]4)对CID-ETD融合谱图进行解析。
[0014]具体地，
[0015]步骤I)所述正电荷衍生选用TMPP-Ac-OSu正电荷衍生试剂。
[0016]步骤2)所述质谱裂解包括以下具体步骤:
[0017]①按照数据依赖模式(Data Dependent Decis1n Tree, DDDT)进行一级质谱谱图米集；
[0018]②在每个一级谱图中选择三个强度最强的离子峰，进行接下来的二级质谱；
[0019]③将每个被选中的离子峰进行一次CID裂解，得到CID谱图；
[0020]④将每个被选中的离子峰再进行一次ETD裂解，得到与步骤③所得CID谱图对应的ETD谱图。
[0021]步骤3)所述谱图的融合包括以下具体步骤:
[0022]①将步骤2所得.raw格式的CID谱图与ETD谱图分别转化为.mgf格式的谱图，转化后的谱图保留转化前谱图中所有母离子与碎片离子的信息；
[0023]②在.mgf格式的ETD谱图中，将各离子峰的质荷比(m/z)换算为离子的分子量，将分子量小于m、分子量大于η以及分子量分别等于p、q、r的离子移除，只保留一价c系列离子；
[0024]其中，
[0025]m = 646 ；
[0026]n = (m/z) 二价母离子 *2-128 ;
[0027]P = (m/z) 二价母离子 ±3.015 ；
[0028]q = [ (m/z) 二价母离子 *2—168.0781] ±3.015 ;
[0029]r = [(m/z) 二价母离子*2—533.1935] ±3.015 ；
[0030]③将一价c系列离子各自的分子量减去17.02655，得到虚拟的一价b系列离子；
[0031]④将虚拟的一价b系列离子的离子峰强度调整到与对应的CID谱图中最强的离子峰强度相等；
[0032]⑤将步骤④所得ETD谱图叠加到对应的.mgf格式的CID谱图中，得到CID-ETD融合谱图，该谱图中只含有一价b系列离子。
[0033]步骤4)所述谱图解析的工具选用PEAKS工作站。
[0034]本发明还提供了所述方法在多肽从头测序中的应用。
[0035]所述应用包括对基因组未测序物种多肽的从头测序。
[0036]本发明的技术特点在于:[0037]本发明用简易的方法将同一多肽的ETD谱图与CID谱图相融合，融合后的CID-ETD融合谱图有着突出的技术效果:其包含目标多肽完整的一价b系列离子，使大量的不能通过CID谱图或ETD谱图得到解析的多肽序列可以被成功解析出来。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1，为草鲤多肽混合物的从头测序鉴定结果；其中，(a)为被鉴定多肽的假阳性率分布图，(b)为被鉴定多肽的检索分数分布图。
[0039]图2，为根据CID-ETD融合谱图分析得到的草鲤非已知多肽序列“SNTLNFAVGYK” (A)和 “LQAALDNEANR” (B)。
[0040]图3，为经过正电荷衍生后的已知序列多肽“HADICTLPDTEK”的质谱谱图以及使用PEAKS工作站对质谱谱图进行分析得到的多肽序列；其中，A为多肽的CID谱图；B为根据CID谱图分析得到的多肽序列；C为多肽的ETD谱图；D为根据ETD谱图分析得到的多肽序列；E为多肽的CID-ETD融合谱图；F为根据CID-ETD融合谱图分析得到的多肽序列。
【具体实施方式】
[0041]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0042]实施例1:
[0043]1、样品来源:
[0044]使用细胞裂解液提取来自基因组未测序草鲤的背部组织蛋白，所述细胞裂解液含有7M尿素、2M硫脲、2% CHAPS、10%核酸酶和1%蛋白酶抑制剂；取蛋白样品lOOmg，使用12.5%的SDS-PAGE凝胶进行蛋白质分离；经6_250染色后，将含有蛋白质的凝胶带切下；使用1mM的DTT和25mM的碘乙酰胺对蛋白质进行还原与封闭；使用胰蛋白酶对蛋白质进行酶切；多肽混合物即得。
[0045]2、实验步骤:
[0046]I)多肽的衍生:
[0047]①反应体系的制备与平衡:在20 μ L的Eppendorf枪头底部由下至上顺序设置C8填料层、SCX填料层和C8填料层，得到C8-SCX-C8衍生反应体系；将反应体系用100 μ L45%的乙腈清洗，用10yL0.1%的三氟乙酸平衡；
[0048]②衍生反应:将步骤I所得多肽混合物约50 μ g与TMPP-Ac-OSu试剂(购自Sigma公司)ΙΟΟμ g混合溶解于含5%乙腈与0.1 %三氟乙酸的水溶液，载入反应体系最上层；载入pH8.2、浓度为20mmol/L的碳酸氢钠缓冲液100 μ L引发衍生反应；室温下孵育2小时后，使用0.1 %的三氟乙酸ΙΟΟμ L清洗，终止反应；
[0049]③副产物的去除:使用ρΗ3.0、含有5mmol/L的磷酸二氢钾和45%的乙腈的缓冲液100 μ L进行洗脱；待以TMPP-Ac-OH为主的反应副产物去处后，使用ρΗ3.0、含有5mmol/L的磷酸二氢钾、500mmol/L的氯化钾和45%的乙腈的缓冲液100 μ L进行洗脱；
[0050]④衍生多肽的脱盐与洗脱:使用0.1 %三氟乙酸100μ L进行脱盐，使用45%的乙腈100 μ L进行洗脱，衍生多肽样品即得。
[0051]2)多肽的质谱分析:
[0052]①分析方法:LC_MS/MS；[0053]②仪器:LTQOrbitrap XL,购自 ThermoFisher Scientific 公司；
[0054]③色谱条件:
[0055]进样量:1yL;
[0056]固定相:C8；
[0057]流动相:流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈溶液；
[0058]流动相梯度洗脱模式为:
【权利要求】
1.一种基于CID与ETD质谱谱图融合的多肽从头测序方法，该方法包括以下步骤:I)对多肽进行N-末端正电荷衍生；2)对步骤I)所得衍生多肽分别进行CID质谱裂解与ETD质谱裂解；3)将步骤2)所得CID谱图与ETD谱图融合，得到CID-ETD融合谱图；4)对CID-ETD融合谱图进行解析。
2.根据权利要求1所述的多肽从头测序方法，其特征在于，步骤I)所述正电荷衍生选用TMPP-Ac-OSu正电荷衍生试剂。
3.根据权利要求1所述的多肽从头测序方法，其特征在于，步骤2)所述质谱裂解包括以下具体步骤: ①按照数据依赖模式进行一级质谱谱图采集； ②在每个一级谱图中选择三个强度最强的离子峰，进行接下来的二级质谱； ③将每个被选中的离子峰进行一次CID裂解，得到CID谱图； ④将每个被选中的离子峰再进行一次ETD裂解，得到与步骤③所得CID谱图对应的ETD谱图。
4.根据权利要求1所述的多肽从头测序方法，其特征在于，步骤3)所述谱图的融合包括以下具体步骤: ①将步骤2)所得.raw格式的CID谱图与ETD谱图分别转化为.mgf格式的谱图，转化后的谱图保留转化前 谱图中所有母离子与碎片离子的信息； ②在.mgf格式的ETD谱图中，将各尚子峰的质荷比(m/z)换算成尚子的分子量,将分子量小于m、分子量大于η以及分子量分别等于P、q、r的离子移除，只保留一价c系列离子； 其中， m = 646 ；
n = (m/z) 二价母离子 *2-128 ；
P = (m/z) 二价母离子土 3.015 ；
q = [ (m/z) 二价母离子*2—168.0781] ±3.015 ；
r = [ (m/z) 二价母离子 *2—533.1935] ±3.015 ； ③将一价c系列离子各自的分子量减去17.02655，得到虚拟的一价b系列离子； ④将虚拟的一价b系列离子的离子峰强度调整到与对应的CID谱图中最强的离子峰强度相等； ⑤将步骤④所得ETD谱图叠加到对应的.mgf格式的CID谱图中，得到CID-ETD融合谱图，该谱图中只含有一价b系列离子。
5.根据权利要求1所述的多肽从头测序方法，其特征在于，步骤4)所述谱图解析的工具选用PEAKS工作站。
6.权利要求1所述方法在多肽从头测序中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括在基因组未测序物种多肽从头测序中的应用。
【文档编号】G01N27/62GK104034791SQ201410184470
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月4日 优先权日:2014年5月4日
【发明者】纪建国, 王青松, 安明瑞 申请人:北京大学