一种细毛羊皮肤组织中毛囊蛋白质2-de图谱的构建的制作方法
【专利摘要】本发明提供的一种细毛羊皮肤组织中毛囊蛋白质2-DE图谱的构建,通过构建细毛羊毛囊蛋白质的双向电泳体系，从蛋白质水平上筛选与羊毛细度相关的蛋白质，较为直接和全面的发现相关蛋白在不同纤维直径的细毛羊皮肤组织毛囊中的表达和调控规律，进而可以通过鉴定蛋白质的功能与属性推测出相关的候选基因，对于细毛羊的遗传繁育具有重要意义，为后期的细毛羊毛囊蛋白的蛋白质组学分析奠定基础。
【专利说明】一种细毛羊皮肤组织中毛囊蛋白质2-DE图谱的构建
【技术领域】
[0001] 本发明涉及羊毛囊蛋白质表达的研究，建立的2-DE图谱具有重要的实用价值及 实践意义。
【背景技术】
[0002] 国外在优质细毛羊培育方面，多利用传统育种和分子育种相结合的手段来开展研 究，澳大利亚、新西兰和法国等国家多年来一直在进行羊毛生产性状的QTL定位研究，如 Allain等，1998;Ponz等，2001;Bidinost等，2006。
[0003] 国内对绵羊羊毛细度性状的分子标记研究也比较多，如马玉萍，2003;徐新明， 2007。在绵羊上运用双向电泳技术也有很多报道，如于国庆等，2013通过使用热的SDS法制 备绵羊血浆蛋白样品，通过双向电泳、硝酸银染色得到绵羊血浆蛋白质组的2-DE图谱。裴 艳涛等，2007利用不同裂解法提取绵羊肺炎支原体菌体蛋白，通过固相pH梯度等电聚焦双 向电泳的方法，建立绵羊肺炎支原体蛋白质组学研究的双向电泳图谱及其相关技术体系。 Gillian，2010通过双向电泳方法对绵羊被病毒感染后的蛋白质细胞与先天具有免疫功能 的蛋白质做对比，以探究蛋白的调控机理。为绵羊疾病的防治奠定基础。松杰等，2012采用 液氮研磨法提取蛋白质，利用双向电泳技术对蛋白质进行分离，分别对不同的蛋白质沉淀 方法、上样量和SDS-PAGE凝胶浓度进行比较。建立了内蒙古绒山羊皮肤蛋白质双向电泳图 谱。
[0004] 毛囊是控制羊毛生长的附属物，广泛存在于皮肤的表面是一个形态结构较为复杂 的皮肤附属器官，它控制着毛发的生长，具有自我更新和周期性生长的特点。
[0005] 本研究通过构建细毛羊毛囊蛋白质的双向电泳体系，从蛋白质水平上筛选与羊毛 细度相关的蛋白质，较为直接和全面的发现相关蛋白在不同细毛羊皮肤组织中的表达和调 控规律，进而可以通过鉴定蛋白质的功能与属性推测出相关的候选基因，对于细毛羊的遗 传繁育具有重要意义。另外，国内外的研究多集中于在基因组和转录组水平上研究，在细毛 羊上运用双向电泳技术分析蛋白质表达差异是本研究的创新点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于：以毛囊进行研究更加直观而准确的寻找出与羊毛细度相关的 蛋白，建立细毛羊毛囊蛋白质的双向电泳体系，分析不同纤维直径细毛羊蛋白质差异研究。
[0007] 本发明的目的是这样实现的：一种细毛羊皮肤组织中毛囊蛋白质2-DE图谱的构 建，分步实施；
[0008] 样品制备：称取细毛与毛囊的样品0. 4-0. 5g，放入灭菌的研钵中用液氮研磨，研 磨后用TCA法处理，用Bradford法进行定量；
[0009] 双向电泳：设计每根胶条的上样量为100UL、选择18cm、pH4-7的线性IPG胶条； [0010] 1)等电聚焦
[0011] 水化结束，在移至聚焦盘中的胶条两头，加2.8-3. 2mL矿物油并固定电极板，打开 聚焦仪，设置胶条数目与电聚焦程序；
[0012] 2)平衡
[0013] 等电聚焦结束，将IPG胶条取出，用MilliQ水湿的滤纸吸干表面矿物油及多余样 品，放入平衡液A中平衡15min，结束后，冲洗胶条上的平衡液A，再转入B平衡液中，平衡 15min;平衡时先将低熔点琼脂糖封胶液加热溶解；在第二次平衡后将胶条浸没电泳缓冲 液中，即取出，防止蛋白质损失；
[0014] 配制电泳缓冲液：取18.OOgTris、86. 40g甘氨酸、6.OOgSDS，溶于5LMilliQ水中， 充分混匀，定容至6L。
[0015] 配制低熔点琼脂糖封胶液：取0. 50g低熔点琼脂糖、0. 30gTris、1.44g甘氨酸、 10%SDSlmU溴酚蓝储存液IOOiiL，用MilliQ水定容至IOOmL,加热溶解至澄清，室温保 存；
[0016] 其中溴酚蓝储存液：取0?Ig溴酚蓝、60mg Tris-base，用MilliQ水定容至10mL。
[0017] 配制胶条平衡缓冲液A:取胶条平衡缓冲液母液10mL，室温溶解，加入0. 20gDTT， 充分混匀即可使用；
[0018] 配制胶条平衡缓冲液B:取胶条平衡缓冲液母液10mL，室温溶解，加入0. 25g碘代 乙酰胺，充分混匀即可使用；
[0019] 其中胶条平衡缓冲液母液：取36.OOg尿素、2.OOgSDS、pH8. 8、1. 5mol/L Tris-HC125mL，20mL丙三醇，用MilliQ水定容至lOOmL，分装在IOmL管内，-20°C保存。
[0020] 3) SDS-PAGE垂直电泳
[0021] 在灌胶模具中制好凝胶，用移液枪吸取饱和正丁醇l_2mL加在SDS-PAGE凝胶顶端 上；将玻璃板拆开，用MilliQ水冲洗胶面，放在胶板架上，将溶解好的低熔点琼脂糖封胶液 加上l-2mL，将胶条一端压入玻璃板夹层中与SDS-PAGE凝胶之间没有空隙，再用低熔点琼 脂糖封胶液封住胶条；
[0022] 4)凝胶染色
[0023] 用硝酸银染色法的染色试剂：
[0024] 丙烯酰胺单体储存液：取30gAcr、0. 8gBis、溶于400mLMilliQ水中，定容至 500mL，用0. 45iim的微孔滤膜过滤后，4°C避光保存；
[0025] 12%丙烯酰胺凝胶液40mL/块：取49. 5mLMilliQ水、60mL丙烯酰胺单体储存液、 37. 5mLTris-HCL、pH8. 8,1. 5mL10%SDS、0. 15gAp溶于I. 5mlMilliQ水中，25.LTEMED 溶于 225iiLMilliQ水中。
[0026] 5)图象的扫描与分析
[0027] 应用ImageMaster2D platinum软件对两岁的不同细型的细毛羊的2-DE凝胶图谱 进行分析，检测出表达丰度上在2倍以上的35个差异蛋白。
[0028] 本发明的机理与作用：方法比较得出TCA/丙酮法最适合细毛羊毛囊组织总蛋白 质的提取；选择上样量为IOOu L，选择18cm，pH4-7的线性IPG胶条，得到质量较好的双向 凝胶电泳图谱；应用ImageMaster2D platinum软件对两岁的不同细型的细毛羊的2-DE凝 胶图谱进行分析，检测出表达丰度上在2倍以上的35个差异蛋白，为后续优质细毛羊蛋白 质组学奠定基础，对于研究不同纤维直径的细毛羊差异蛋白质的调控具有重要意义，彰显 技术进步。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0030] 附图1为三种不同提取方法处理的双向电泳图；
[0031] 如图所示：A为TCA沉淀法、B为酚抽提法、C为TCA/丙酮法。
[0032] 附图2不同上样量对双向电泳图谱的影响示意图；
[0033] 如图所示：A为上样量80iiL、B为上样量100iiL、C为上样量120iiL。
[0034] 附图3不同pH范围的IPG胶条对双向电泳图谱的影响示意图；
[0035] 如图所示：A为pH3-10的IPG胶条影响图谱；B为pH4-7的IPG胶条影响图谱。
[0036] 附图4为两岁不同细度细毛羊差异表达的蛋白点电泳示意图；
[0037] 如图所示：A为超细型细毛羊、B为细型细毛羊。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明作详细的描述。
[0039] 实施例
[0040] 1材料与方法
[0041]I. 1实验动物
[0042] 本研究所用的细型细毛羊，羊毛纤维直径极粗在20. 82iim或25. 43iim和超细型 细毛羊，羊毛纤维直径极细在14. 64ym或17. 44ym，样本均为同一毛囊部位，置于液氮中 冷冻，保存。
[0043] 1. 2主要试剂
[0044] 18cm固相线性pH梯度胶条为GE医疗公司产品；IPGbuffer为博士德公司产品； 碘代乙酰胺、矿物油、丙三醇、硫脲为SIGMA公司产品；IPGbuffer为BIO-RAD公司产品；二 硫苏糖醇（DTT)、CHAPS、尿素（Urea)为BI0SHARP;低熔点琼脂糖、；四甲基乙二胺（TEMED)、 丙烯酰胺（Acr)、甲叉双丙烯酰胺（Bis-Acrylamide)、过硫酸胺（Ap)、溴酚蓝、EDTA、三（轻 甲基）氨基甲烷（Trisbase)、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（SDS)、Tris-HCl(pH6. 8)所需耗材 均由北京鼎国生物技术有限公司提供；硝酸银（AgNO3)为国药集团提供；五水硫代硫酸钠、 无水碳酸钠由索莱宝生物技术有限公司提供。
[0045] 1.3样品的制备用剪刀将细毛与毛囊部分分离，电子天平称取样品，保证每份样 品总质量在〇.5g左右，放入事先灭菌后的研钵中用液氮研磨充分，将预处理好的样品分 为三份，一份用TCA/丙酮抽提法处理，一份为TCA沉淀法处理，另一份用酚抽提法提取 (Carpentier等，2005)，本实验米用Bradford法进行定量（Pasquali等，1997)。
[0046] 1.4双向电泳
[0047] 先用PH3-10的IPG胶条分离皮肤组织中的毛囊总蛋白，发现蛋白点主要集中在 PH4-7之间，为了使大部分蛋白得到更好地分离，得到较为理想的电泳图谱，改用了pH4-7 的IPG胶条，实验中使用pH4-7,长度为18cm长的IPG线性胶条，这样有助于将皮肤组织中 的毛囊总蛋白在2-DE图像上整体分布开，在保证其他实验条件一致的情况下，上样量为： 18cm，pH4-7的线性IPG胶条；设计每根胶条样品上样量分别为80iiL、100iiL、120iiL，上样 总体积为450iiL，18cm，pH4-7的线性IPG胶条。
[0048]I. 4. 1等电聚焦
[0049] 水化结束后，将胶条从水化槽中移至聚焦盘中，将厚滤纸润洗好放在胶条两头，力口 入3mL矿物油在胶条上，两头固定电极板，按表1所示设计等电聚焦程序：
[0050] 表1等点聚焦参数的设置（IPGpH4-7, 18cm)
[0051]
【权利要求】
1. 一种细毛羊皮肤组织中毛囊蛋白质2-DE图谱的构建，其特征在于：分步实施； 样品制备：称取细毛与毛囊的样品0. 4-0. 5g，放入灭菌的研鉢中用液氮研磨，研磨后 用TCA法处理，用化a壯ord法定量； 双向电泳：设计每根胶条的上样量为100 y L，选择18 cm、pH 4-7的线性IPG胶条； 1) 等电聚焦 水化结束，在移至聚焦盘中的胶条两头，加2.8-3. 2mL矿物油并固定电极板，打开聚焦 仪，设置胶条数目与电聚焦程序； 2) 平衡 等电聚焦结束，将IPG胶条取出，用MilliQ水湿的滤纸吸干表面矿物油及多余样品， 放入平衡液A中平衡15min，结束后，冲洗胶条上的平衡液A，再转入B平衡液中，平衡15 min ;平衡时先将低烙点琼脂糖封胶液加热溶解；在二次平衡后将胶条浸没在电泳缓冲液 中，即可取出，防止蛋白质损失； 配制电泳缓冲液：取18. OOg Tris、86. 40g甘氨酸、6. OOg SDS，溶于5 LMilliQ水中，充 分混匀，定容至6 L ; 配制低烙点琼脂糖封胶液；取0. 50g低烙点琼脂糖、0. 30g TrisU. 44g甘氨酸、10% SDS 1血、漠酷蓝储存液100 y L，用MilliQ水定容至100血，加热溶解至澄清，室温保存； 其中漠酷蓝储存液；取0. Ig漠酷蓝、60mg Tris-base，用MilliQ水定容至10血； 配制胶条平衡缓冲液A ;取lOmL胶条平衡缓冲液母液，室温溶解，加入0. 20g DTT，充分 混匀使用； 配制胶条平衡缓冲液B ;取lOmL胶条平衡缓冲液母液，室温溶解，加入0. 25g楓代己醜 胺，充分混匀使用； 其中胶条平衡缓冲液母液；取36. OOg尿素、2. OOg SDS、P服.8、1. 5mol/L Tris-肥1 25血，20血丙H醇、用MilliQ水定容至100血，分装在10血管内，-20°C保存； 3. SDS-PAGE垂直电泳 制好凝胶，用移液枪吸取饱和正下醇l-2mL加在SDS-PAGE凝胶顶端上；将玻璃板拆 开，用MilliQ水冲洗胶面，放在胶板架上，加低烙点琼脂糖封胶液l-2mL，将胶条一端压入 玻璃板夹层中与SDS-PAGE凝胶之间无空隙，再用低烙点琼脂糖封胶液封住胶条； 4) 凝胶染色 采用硝酸银染色法的染色试剂： 配制丙帰醜胺单体储存液；取30g Acr、0. 8g Bis,溶于400血MilliQ水中，定容至 500mU用0. 45 y m的微孔滤膜过滤后，4°C避光保存； 配制12%丙帰醜胺凝胶液40血/块：取49. 5血MilliQ水、60血丙帰醜胺单体储存液、 37. 5血 Tris-肥L、抑8. 8,1. 5mL 10%SDS、0. 15gAp 溶于 1. 5mlMilliQ 水中，25. 5 y L TEMED 溶 于 225 y LMilliQ 水中； 5) 图象的扫描与分析 应用ImageMaster 2D platinum软件对两岁的不同细型的细毛羊的2-DE凝胶图谱进行 分析，检测出表达丰度上在2倍W上的35个差异蛋白。
2. 依据权利要求1所述2-DE图谱的构建，其特征在于；实验选用原料、制剂均为市售 产品。
【文档编号】G01N27/26GK104345078SQ201410223498
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】田可川, 黄锡霞, 杨洁, 付雪峰, 徐新明, 石刚, 狄江, 詹振宏, 张艳花, 哈尼克孜, 于丽娟, 薛多雄 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院畜牧研究所, 新疆农业大学