一种同时检测血浆中复方丹蒌片主要成分的方法
【专利摘要】本发明提供了一种液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)同时检测血浆样本中复方丹蒌片主要成分葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的方法。所述液相色谱中，流动相由乙腈和体积分数为0.1％的甲酸水溶液组成，采用梯度洗脱。所述质谱采用正负离子快速切换分析模式，MRM扫描方式。同时测定给药丹蒌片后，大鼠血浆中这几种主要成分的血药浓度变化情况。方法学考察结果表明所建立的方法符合体内生物样品测定要求，方法灵敏度好，专属性强，稳定、可靠，适宜含量较低物质的检测。
【专利说明】—种同时检测血浆中复方丹蒌片主要成分的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药领域，具体涉及一种同时检测血浆中复方丹萎片主要成分的分析方法及其在药代动力学中的应用。
【背景技术】
[0002]复方丹萎片是由瓜萎皮、薤白、葛根、川芎、丹参、赤芍、泽泻、黄芪、骨碎补、郁金，十味中药组成的上市中成药。临床主要用于宽胸通阳、化痰散结、活血化瘀，用于痰瘀互结所致的胸痹心痛，症见胸闷胸痛、憋气、舌质紫暗、苔白腻；冠心病心绞痛见上述证候者。文献报道其主要成分为黄酮类、酚酸类、丹参酮类、三萜烷类、内酯类和芍药苷等，并且葛根素、芍药苷、丹参酮类成分在片剂中的含量较高。葛根素、芍药苷、芒柄花黄素、丹参酮II A、隐丹参酮分别是葛根、赤芍、葛根和黄芪、丹参中的主要成分，大量文献对其药理活性进行了报道。但还没有文献同时对这几种成分的药代动力学进行报道，对复方丹萎片药效物质基础研究的文章也未见有报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)同时检测血浆样本中复方丹萎片主要成分葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮的方法。并采用该方法对复方丹萎片中这几种成分的药代动力学特点进行研究，进一步了解复方丹萎片的吸收入血成分及其血药浓度变化情况，为阐明复方丹萎片的药物作用机制提供指导。
[0004]本发明所提供的方法包括:步骤(I)样品的制备和步骤(2)采用液相色谱串联质谱法进行检测；
[0005]步骤(I)样品的制备采用包括以下步骤的方法:
[0006]a)向待测血浆样品中加入混合内标溶液、甲酸，并混匀；
[0007]b)加入乙酸乙酯提取剂，混匀后静置；
[0008]c)离心，收集上清液，氮气吹干，收集干燥物；
[0009]d)将得到的干燥物用甲醇复溶，混匀、离心，取上清液。
[0010]步骤a)中，所述混合内标溶液中所述内标为大黄素和桅子苷；其中，大黄素作为丹参酮和黄酮类化合物(即葛根素、芒柄花黄素、丹参酮II A和隐丹参酮)的内标，桅子苷作为芍药苷的内标。所述混合内标溶液具体通过包括下述步骤的方法配制:精密称取大黄素1.08mg,桅子苷1.0Omg于IOmL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容至刻度线，分别配成内标大黄素、桅子苷的储备液；精密移取各内标储备液适量，用甲醇稀释，配制成含大黄素1.08 μ g/mL'桅子苷5.00 μ g/mU1的混合内标溶液。
[0011]所述步骤a)中，所述待测血浆样品与甲酸的体积比为100:20。
[0012]所述步骤b)中，所述静置的时间为2_5min。所述待测血浆样品与乙酸乙酯的体积比为 1:5-10。
[0013]所述步骤d)中，在离心步骤前还可包括对混匀后的产物进行超声的步骤。[0014]所述超声的时间为30-60S。
[0015]步骤a)、b)、c)和d)中，所述混匀均采用涡旋的方式，涡旋的时间均为l_2min。
[0016]步骤c)和d)中，所述离心的条件均为18000Xg-19000Xg离心10_15min。
[0017]步骤(2)检测所用液相色谱条件如下:
[0〇18]色谱柱为C18柱；
[0019]流动相由乙腈和体积分数为0.1% (v/v)的甲酸水溶液组成；
[0020]洗脱方式为梯度洗脱；
[0021]所述梯度洗脱的程序如下:
[0022]O-1Omin:乙腈的体积分数由10%增加至30% ；
[0023]10-15min:乙腈的体积分数由30%增加至90% ；
[0024]15-24min:乙腈的体积分数维持90%不变；
[0025]步骤⑵检测所用质谱条件如下:采用API3200?LC/MS/MS液质分析系统；Turbo1nSpray?离子源，正负离子快速切换分析模式，MRM扫描方式。
[0026]所述液相色谱条件中，色谱柱具体为Agilent Eclipse Plus C18柱(4.6mmX 100mm, 1.8 μ m);流动相流速为400 μ L/min ;柱温为30°C ;进样量为5 μ L。
[0027]所述质谱条件中，所述正负离子快速切换分析模式中，正离子模式参数设置为:气帘气(CUR):30psi ;碰撞气(CAD) =IOpsi ;离子喷雾电压(IS):5500V ;温度(TEM):450°C ；气流I(GSl):30psi ;气流2(GS2):60psi ;加热(Ihe):0η ;负离子模式参数设置为:气帘气(CUR):15psi ;碰撞气(CAD):12psi ;离子喷雾电压(IS):-4500V ;温度(TEM):450°C ;气流I(GSl):30psi ;气流 2(GS2):40psi ;加热(Ihe):0η。
[0028]所述MRM方法的参数如下:
[0029]葛根素:母离子质量数(Ql):415.3;碎片离子质量数(Q3):295.1;解簇电压(DP):-65V;入口电压(EP):-6V;采样时间(Dwell Time): 100 ;碰撞能:_32V ;碰撞池出口电压(CXP):-20V ;保留时间(Rt):9.0Omin ；
[0030]芒柄花黄素:母离子质量数(Ql) =267.3 ;碎片离子质量数(Q3):252 ;解簇电压(DP):-48V ;入口电压(EP):-5V ;采样时间(Dwell Time):100 ;碰撞能:-30V ;碰撞池出口电压(CXP):-25V;保留时间(Rt):17.05min ；
[0031]芍药苷:母离子质量数(Ql):449.1 ;碎片离子质量数(Q3):327.1 ;解簇电压:_56V ;入口电压(EP):-7V ;采样时间(Dwell Time):100 ;碰撞能:_15V ;碰撞池出口电压(CXP):-26V ;保留时间(Rt):11.1lmin ；
[0032]隐丹参酮:母离子质量数(Ql) =297.3 ;碎片离子质量数(Q3):251.3 ;解簇电压:70V ;入口电压(EP):6V ;采样时间(Dwell Time):100 ;碰撞能:30V ;碰撞池出口电压(CXP):21V;保留时间(Rt):19.76min ；
[0033]丹参酮II A:母离子质量数(Ql):295.3 ;碎片离子质量数(Q3):249.2;解簇电压:80V ;入口电压(EP):4.5V ;采样时间(Dwell Time):100 ;碰撞能:35V ;碰撞池出口电压(CXP):32V;保留时间(Rt):20.96min ；
[0034] 大黄素(SI):母离子质量数(Ql) =269.1 ;碎片离子质量数(Q3):225.1 ;解簇电压:-65V ;入口电压(EP):-7V ;采样时间(Dwell Time):100 ;碰撞能:-39V ;碰撞池出口电压(CXP):-15V;保留时间(Rt):18.31min ；[0035]桅子苷(S2):母离子质量数(Ql):387.0 ;碎片离子质量数(Q3):224.8 ;解簇电压:-40V ;入口电压(EP):-5V ;采样时间(Dwell Time):100 ;碰撞能:-16V ;碰撞池出口电压(CXP):-5V;保留时间(Rt):9.63min。
[0036]本发明还包括一种液相色谱串联质谱法同时检测血浆样本中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮的含量的方法，具体包括下述步骤:
[0037]I)标准曲线的制备:取一系列浓度的葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮的混合标准品溶液加入空白血浆样品中，按照上述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照上述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录每个浓度的葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮对应的峰面积；以葛根素与内标峰面积比值Y为纵坐标，以葛根素浓度X为横坐标，制备葛根素的线性回归方程；以芒柄花黄素与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芒柄花黄素浓度X为横坐标，制备芒柄花黄素的线性回归方程；以芍药苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芍药苷浓度X为横坐标，制备芍药苷的线性回归方程；以丹参酮II A与内标峰面积比值Y为纵坐标，以丹参酮II A浓度X为横坐标，制备丹参酮II A的线性回归方程；以隐丹参酮与内标峰面积比值Y为纵坐标，以隐丹参酮浓度X为横坐标，制备隐丹参酮的线性回归方程；
[0038]2)待测血浆样品中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮的含量测定:将待测血浆样品按照上述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照上述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮对应的峰面积；计算葛根素与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述葛根素的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中葛根素的浓度；计算芒柄花黄素与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述芒柄花黄素的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中芒柄花黄素的浓度；计算芍药苷与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述芍药苷的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中芍药苷的浓度；计算丹参酮II A与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述丹参酮II A的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中丹参酮II A的浓度；计算隐丹参酮与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述隐丹参酮的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中隐丹参酮的浓度。
[0039]本发明所述方法可成功用于复方丹萎片主要成分(葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮)的药代动力学研究。
[0040]所述复方丹萎片由下列质量份的原料制成:瓜萎皮30-145重量份、薤白15-65重量份、葛根55-220重量份、川芎20-85重量份、丹参55-220重量份、赤芍20-85重量份、泽泻55-220重量份、黄芪50-180重量份、骨碎补10_40重量份、郁金20-85重量份。
[0041]制备方法如下:取原料药，川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜萎皮、薤白加70%乙醇加热回流提取1-3次，每次1-2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30 (65 °C );葛根和丹参，单包，加乙醇回流提取2-4次，每次0.5-2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30 (650C );黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮1_3次，每次1_2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30 (650C );将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂。
[0042]本发明建立了液液萃取的大鼠血浆样品处理方法、采用液质联用(LC-ES1-MS/MS)的分析法，同时测定给药丹萎片后，大鼠血浆中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、隐丹参酮和丹参酮II A的血药浓度变化情况，并对其进行方法学考察。结果表明所建立的方法符合体内生物样品测定要求，方法灵敏度好，专属性强，稳定、可靠，适宜含量较低物质的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1为测定的血浆样品的色谱图，其中，(a)为空白血浆色谱图；(b)为空白血浆中加入各化合物及内标的色谱图；(c)为大鼠给6g/kg丹萎片后30min的血浆色谱图。
[0044]图2为大鼠血浆中各成分的血药浓度-时间曲线，其中，a为大鼠血浆中葛根素的血药浓度-时间曲线山为大鼠血浆中芒柄花黄素的血药浓度-时间曲线；c为大鼠血浆中芍药苷的血药浓度-时间曲线；d为大鼠血浆中隐丹参酮的血药浓度-时间曲线；e为大鼠血浆中丹参酮II A的血药浓度-时间曲线。
【具体实施方式】
[0045]下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
[0046]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047]下述实施例中所用的药材复方丹萎片由吉林康乃尔药业提供。下述实施例中所用的试剂:
[0048]乙腈(美国Fisher)
[0049]超纯水(Mi 11 ipore超纯水净化系统制得)
[0050]甲醇(色谱级别，天津市康科德科技有限公司)
[0051]乙酸乙酯(分析纯级别，天津市康科德科技有限公司)
[0052]甲酸(高纯，含量>99.99%，天津市光复精细化工研究所)
[0053]下述实施例中所用的仪器:
[0054]液质联用仪:Agilentl200高效液相色谱仪，API3200串接四极杆质谱仪
[0055]超纯水器:Mi11 ipore 公司，Mi I1-Q II 型
[0056]高速离心机:美国Sigma公司，3K15
[0057]超低温冰箱:美国Thermo Heto公司，_86°C
[0058]超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司，KQ-250E
[0059]氮吹仪:美国Organomation 公司，N_EAVP?111
[0060]十万分之一天平:瑞士Mettler Toledo 公司，AX205
[0061]万分之一天平:德国Sartorius公司，BP121S
[0062]旋涡混合器:上海沪西分析仪器厂，XW-80A
[0063]下述实施例中所用的试验动物:
[0064]健康雄性大鼠，品系SD，级别SPF级，体重200±20g，购自天津市山川红实验动物科技有限公司。
[0065]下述实施例中所用的五种待测物标准品:葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A,隐丹参丽(中国药品生物制品检定所，纯度> 98% )
[0066]内标:大黄素、振子昔(中国药品生物制品检定所，纯度> 98% )。[0067]本研究首先对沉淀蛋白的方法进行了优化，对沉淀试剂甲醇与样品的体积比进行了考察，结果见表1。
[0068]表1甲醇比例对五种化合物的回收率和基质效应的影响
【权利要求】
1.一种液相色谱串联质谱法同时检测血浆样本中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮的方法，包括:步骤⑴样品的制备和步骤(2)采用液相色谱串联质谱法进行检测； 所述步骤(1)样品的制备采用包括以下步骤的方法: a)向待测血浆样品中加入混合内标溶液、甲酸，并混匀；所述混合内标溶液中内标为大黄素和桅子苷；其中，大黄素作为葛根素、芒柄花黄素、丹参酮II A和隐丹参酮的内标,桅子苷作为芍药苷的内标； b)加入乙酸乙酯提取剂，混匀后静置； c)离心，收集上清液，氮气吹干，收集干燥物； d)将得到的干燥物用甲醇复溶，混匀、离心，取上清液； 所述步骤(2)检测所用液相色谱条件如下: 色谱柱为C18柱； 流动相由乙腈和体积分数为0.1 %甲酸水溶液组成； 洗脱方式为梯度洗脱； 所述梯度洗脱的程序如下: O-1Omin:乙腈的体积分数由10%增加至30% ； 10-15min:乙腈的体积分数由30%增加至90% ； 15-24min:乙腈的体积分数维持90%不变。
2.一种液相色谱串联质谱法同时检测血浆样本中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮的含量的方法，包括下述步骤: .1、标准曲线的制备: 取一系列浓度的葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮的混合标准品溶液加入空白血浆样品中，按照权利要求1所述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照权利要求1所述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录每个浓度的葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮对应的峰面积； 以葛根素与内标峰面积比值Y为纵坐标，以葛根素浓度X为横坐标，制备葛根素的线性回归方程； 以芒柄花黄素与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芒柄花黄素浓度X为横坐标，制备芒柄花黄素的线性回归方程； 以芍药苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芍药苷浓度X为横坐标，制备芍药苷的线性回归方程； 以丹参酮II A与内标峰面积比值Y为纵坐标，以丹参酮II A浓度X为横坐标，制备丹参酮II A的线性回归方程； 以隐丹参酮与内标峰面积比值Y为纵坐标，以隐丹参酮浓度X为横坐标，制备隐丹参酮的线性回归方程； .2、待测血浆样品中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮IIA和隐丹参酮的含量测定: 将待测血浆样品按照权利要求1所述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照权利要求1所述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮对应的峰面积；计算葛根素与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述葛根素的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中葛根素的浓度； 计算芒柄花黄素与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述芒柄花黄素的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中芒柄花黄素的浓度； 计算芍药苷与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述芍药苷的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中芍药苷的浓度； 计算丹参酮II A与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述丹参酮II A的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中丹参酮II A的浓度； 计算隐丹参酮与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述隐丹参酮的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中隐丹参酮的浓度。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤a)中，所述待测血浆样品与甲酸的体积比为100:20 ； 步骤b)中，所述静置的时间为2-5min;所述待测血浆样品与乙酸乙酯的体积比为1:5-10 ； 步骤a)、b)、c)和d)中，所述混匀均采用涡旋的方式，涡旋的时间均为l-2min; 步骤c)和d)中，所述离心的条件均为18000Xg_19000Xg离心10_15min。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于:所述液相色谱条件中，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18柱，规格为-A.6mmX 100mm,填料直径为1.8 μ m ;流动相流速为400 μ L/min ;柱温为50°C ;进样量为5 μ L。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于: 步骤⑵检测所用质谱条件如下:采用API3200?LC/MS/MS液质分析系统；Turbo1nSpray?离子源，正负离子快速切换分析模式，多反应监测扫描方式。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于:所述质谱条件中，所述正负离子快速切换分析模式中，正离子模式参数设置为:气帘气:30psi ;碰撞气:IOpsi ;离子喷雾电压:5500V ;温度:4500C ;气流 I:30psi ;气流 2:60psi ;加热； 负离子模式参数设置为:气帘气:15psi ;碰撞气:12psi ;离子喷雾电压:-4500V ;温度:4500C ;气流 I:30psi ;气流 2:40psi ;加热。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于:所述质谱条件中，所述多反应监测方法参数如下: 葛根素:母离子质量数:415.3 ;碎片离子质量数:295.1 ;解簇电压:_65V ;入口电压:-6V ;采样时间:100 ;碰撞能:-32V ;碰撞池出口电压:-20V ;保留时间:9.0Omin ； 芒柄花黄素:母离子质量数:267.3 ;碎片离子质量数:252 ;解簇电压:_48V ;入口电压:-5V ;采样时间:100 ;碰撞能:-30V ;碰撞池出口电压:-25V ;保留时间:17.05min ； 芍药苷:母离子质量数:449.1 ;碎片离子质量数:327.1 ;解簇电压:_56V;入口电压:-7V ;采样时间:100 ;碰撞能:-15V ;碰撞池出口电压:-26V ;保留时间:11.1lmin ； 隐丹参酮:母离子质量数:297.3 ;碎片离子质量数:251.3 ;解簇电压:70V ;入口电压:6V ;采样时间:100 ;碰撞能:30V ;碰撞池出口电压:21V ;保留时间:19.76min ； 丹参酮II A:母离子质量数:295.3 ;碎片离子质量数:249.2 ;解簇电压:80V ;入口电压:4.5V ;采样时间:100 ;碰撞能:35V ;碰撞池出口电压:32V ;保留时间:20.96min ；大黄素:母离子质量数:269.1 ;碎片离子质量数:225.1 ;解簇电压:_65V;入口电压:-7V ;采样时间:100 ;碰撞能:-39V ;碰撞池出口电压:-15V ;保留时间:18.31min ； 桅子苷:母离子质量数:387.0 ;碎片离子质量数:224.8 ;解簇电压:_40V;入口电压:_5V ;采样时间:100 ;碰撞能:_16V ;碰撞池出口电压:_5V ;保留时间:9.63min。
8.权利要 求1-7中任一项所述的方法在测定复方丹萎片中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮II A和隐丹参酮的药代动力学中的应用。
【文档编号】G01N30/88GK104007220SQ201410258709
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月11日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】常艳旭, 吴思丹, 庞玉华, 张鹏, 高秀梅, 李晋, 马文芳 申请人:吉林康乃尔药业有限公司