一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒，该试剂盒包括：(1)CK-MB抗体包被的酶联板；(2)酶标记CK-MB特异性抗体：采用辣根过氧化物酶标记；(3)CK-MB标准溶液：(4)底物显色液：四甲基联苯胺；(5)终止液：盐酸缓冲液；(6)浓缩洗涤液：去离子水；(7)浓缩复溶液：0.1％-5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；该试剂盒检测样本为血清，可以长期保存，检测过程简单、快速，其准确度达到95％以上。
【专利说明】-种检测阿司匹林和氯n比略雷药物双重抵抗的试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种检测阿司匹林和氯化咯雷药物双重抵 抗的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 阿司匹林和氯化咯雷的联合应用，对冠也病患者，尤其是接受了皮冠脉介入术 (PCI)的冠脉综合症患者，能显著防止也血管不良事件的发生，降低死亡率，因此无论是在 欧美，还是国内的冠也病治疗指南中，阿司匹林和氯化咯雷都具有举足轻重的地位。但是， 随着阿司匹林和氯化咯雷等药物使用的推广和深入，阿司匹林抵抗者常伴有氯化咯雷抵 抗，因此该类患者在经PCI术后发生血栓栓赛事件的危险增加。部分接受高危PCI患者在 给予阿司匹林和氯化咯雷双重抗血小板治疗时却具有双重抵抗，该类患者是发生血栓栓赛 事件的高危人群，因而该类患者急需预先检测是否具有阿司匹林和氯化咯雷抵抗，从而为 临床规划用药作为参考，预防不良事件发生。但是目前关于阿司匹林和氯化咯雷双重抵抗 的研究还非常有限，缺乏PCI术后冠也病患者的阿司匹林和氯化咯雷双重抵抗检测手段， 也缺乏大规模随机临床研究评估抗血小板药物抵抗冠也病患者对其抗血小板药物抵抗检 测方法和试剂的准确性和特异性，结果导致检测方法效果误差大，特异性低从而使得血小 板抵抗功能检测很难进入临床广泛应用。
【发明内容】
[0003] 为解决W上现有技术问题，本发明的目的是提供一种适用于检测PCI术后患者阿 司匹林和氯化咯雷药物双重抵抗的试剂盒。检测样本为血清，可W长期保存，检测过程简 单、快速；通过大规模样本收集和多种手段验证试剂检测结果，其检测准确度和特异性都有 很大帖度提局。
[0004] 为达到上述目的，本发明通过W下技术方案实现：
[0005] -种检测阿司匹林和氯化咯雷药物双重抵抗的试剂盒，包括：
[0006] (1) CK-MB抗体包被的酶联板；
[0007] (2)酶标记CK-MB特异性抗体；采用辣根过氧化物酶标记；
[0008] (3) CK-MB 标准溶液：
[0009] (4)底物显色液；四甲基联苯胺；
[0010] 妨终止液；盐酸缓冲液；
[0011] (6)浓缩洗涂液；去离子水；
[0012] (7)浓缩复溶液；0. 1% -5%牛血清白蛋白的磯酸盐缓冲液。
[0013] 所述的终止液优选为3%的盐酸缓冲液；
[0014] 所述的浓缩复溶液优选为1 %牛血清白蛋白的磯酸盐缓冲液；
[0015] 所述的CK-MB抗体为单克隆抗体，该单克隆抗体的制备方法包括：
[001引 （1)采用6?8周龄Ba化/c小鼠作为免疫动物，CK-MB纯化蛋白免疫原免疫剂量 为50?80 y g/只，首次免疫时将免疫原于等量的弗氏佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注 射，间隔2?3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次。免疫 完成7天后取脾细胞；
[0017] (2)细胞融合与克隆；将脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按照5 ; 1混合，采用HAT培养 基筛选杂交瘤细胞，然后将阳性细胞扩大培养，产生分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离 也去除细胞及其碎片；
[0018] (3)抗体在37 C下做冻干处理，放入-2(TC冷藏；
[0019] 所述的CK-MB抗体包被的酶联板的制作方法包括：
[0020] (1)用包被缓冲液将CK-MB抗体稀释为0. Ol?0. 05 y g/ml浓度的抗体稀释液；
[0021] (2)向酶联板中加入抗体稀释液，赔育，倾去包被液，用洗涂液洗涂，拍干；
[0022] (3)向酶联板的每孔中加入封闭液，赔育，倾去孔内液体，干燥后用铅膜真空密封 保存；
[0023] 所述包被缓冲液为P服.5-10的碳酸盐缓冲液，优选为pH9碳酸盐缓冲液；所述洗 涂液为含有2-6%的吐温-20的去离子水，优选为5%的吐温-20的去离子水；所述封闭液 为含有5% -15%的脱脂奶和0. 1% -2. 5%的人血清白蛋白溶液，优选为10%的脱脂奶和 1 %的人血清白蛋白溶液。
[0024] 本发明与现有技术相比，其详细说明如下：
[0025] 本发明针对的检测对象为PCI术后合用阿司匹林和氯化格雷的患者血清样品，一 般PCI术后病人在服药1个礼拜后检测。
[0026] 目前指南规定使用抗血小板方案是：对于目前广泛使用的药物支架（70 %的为 药物洗脱支架）的患者，放支架后，联合服用阿司匹林和氯化格雷至少一年。美国休斯敦 Methodist DeBak巧也脏中也研究结果显示阿司匹林和氯化格雷双重抵抗为26. 9%，双重 抵抗的机制是血小板反应性全面增加，提示该类接受高危PCI的患者在联合服用阿司匹林 和氯化格雷治疗是，可能提高发生血栓栓赛事件概率。因此对于该一类人群检测是否具有 双重抵抗可W指导药物使用剂量和用药方案，预防血栓事件发生。然而目前国内并没有针 对阿司匹林和氯化格雷双重抵抗的一次性检测方法，而本发明填补了该一空白，提供一种 检测PCI术后患者阿司匹林和氯化咯雷药物双重抵抗的试剂盒，血清样本可长时间保存， 检测过程简单、快速，通过大规模样本收集和多种手段验证试剂检测结果，其检测准确度和 特异性都有很大幅度提高。
[0027] 本发明人通过研究发现利用离子交换柱层析法当CK-MB超过CK总活性的3,或者 通过免疫抑制法当CK-MB超过CK总活性的10时，可W判断出该患者会出现急性也肌梗塞 的几率会加大，故可将其作为急性也肌梗塞的诊断依据。且各种类型的也脏手术后可引起 血清CK-MB活性增强，在并发术间或术后也肌梗塞时升高更为显著，发明人也通过多次研 究发现具有阿司匹林和氯化格雷双重抵抗的患者血清中发现CK-MB较高水平表达，也提示 了 CK-MB的升高与双重抵抗之间有必然的联系。
[0028] 通过上面的研究发现，本发明的试剂盒利用抗原抗体反应测定样品中CK-MB水 平，用纯化的人CK-MB抗体包被酶联板，制成固相抗体，再往包被单抗的微孔中依次加入含 有CK-MB的血清，HRP标记的CK-MB抗体，形成抗体-抗原-酶标记抗体复合物，经过彻底 洗涂后加底物四甲基联苯胺显色，四甲基联苯胺在HRP酶的催化作用下转化为蓝色，在酸 的作用下呈黄色。颜色的深浅与样品中CK-MB含量成正比。在酶标仪450nm波长下测定吸 光值，通过标准曲线计算样品CK-MB含量，若血清CK-MB水平在40?45ng/ml之间，表示阿 司匹林和氯化格雷双重抵抗；=30ng/ml表示无抵抗；在30?40ng/ml表示可能出现双重 抵抗。
[0029] 本说明书和权利要求书所使用的缩写及英文的含义如下所示：
[0030] CK-MB ;肌酸激酶
[0031] HRP ;辣根过氧化物酶
[0032] 本发明试剂盒的具体使用方式如下：
[0033] 1.获取待检样本及样本处理：
[0034] A.常规方法配制抗凝剂，3. 8%构稼酸轴，全血（V);抗凝剂（V) = 9 ;1 ;
[003引 B.全血混匀，4°C，2000X g离也5min，吸取上层2/3体积血清，放置于-2(TC保存。
[0036] 2.用本发明的试剂盒进行检测的步骤：
[0037] A.将试剂盒从冷藏箱中取出，室温平衡15min，每种液体使用前摇匀。标准液做2 个平行试验。
[0038] B.将酶标记CK-MB特异性抗体与浓缩复溶液混合：体积比为10 ;1混合均匀；
[0039] C.加50 U 1 CK-MB标准溶液或待检样品于对应微孔中，再加50 U 1上述混合液，盖 上酶标板盖，室温避光反应Ih ;
[0040] D.打开酶标板盖，将孔内液体甩干，并在吸水纸上拍干酶标板孔底水分；加洗涂 液200 y 1/孔，每次浸泡30s，充分洗涂5次，用吸水纸拍干；
[0041] E.每孔各加入底物显色液50 y 1，再各加入酶标记CK -MB特异性抗体50 y 1，摇床 振荡30s混匀，室温避光显色15min ;
[0042] F.每孔加入50 U 1终止液，在酶标仪450nm处检测OD值，5min内读取吸光度值数 据；
[0043] G.检测结果分析：
[0044] 所测得标准溶液或样本吸光度值的平均值（M)减去空白试验吸光度值（MO)为实 际吸光度值。
[0045] 吸光度值（OD) = M-MO
[0046] M =标准溶液或样本吸光度值的平均值（M)
[0047] MO = 0 y g/L空白试验吸光度值
[0048] W标准品百分吸光率为纵坐标，W标准品浓度（U g/L)的半对数为横坐标，绘制 标准曲线图。将样本的吸光度值（OD)代入标准曲线中，即读出样本对应浓度，再乘W稀释 倍数即为样本中CK-MB实际浓度。
[0049] 现对现有技术存在的阿司匹林或氯化格雷抵抗是检测方法进行比较
[0050]
【权利要求】
1. 一种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒 包括： (1) CK-MB抗体包被的酶联板； (2) 酶标记CK-MB特异性抗体：采用辣根过氧化物酶标记； (3) CK-MB标准溶液： (4) 底物显色液：四甲基联苯胺； (5) 终止液：盐酸缓冲液； (6) 浓缩洗涤液：去离子水； (7) 浓缩复溶液：0. 1%-5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CK-MB抗体为单克隆抗体。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的单克隆抗体的制备方法包括： (1) 采用6~8周龄Balb/c小鼠作为免疫动物，CK-MB纯化蛋白免疫原免疫剂量为 5(Γ80 μ g/只，首次免疫时将免疫原于等量的弗氏佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，间 隔2~3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，免疫完成7天 后取脾细胞； (2) 细胞融合与克隆：将脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按照5 :1混合，采用HAT培养基筛 选杂交瘤细胞，然后将阳性细胞扩大培养，产生分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去 除细胞及其碎片； (3) 抗体在37°C下做冻干处理，放入-20°C冷藏；
4. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的CK-MB抗体包被的酶联板的 制作方法包括： (1) 用包被缓冲液将CK-MB抗体稀释为0. 01~0. 05 μ g/ml浓度的抗体稀释液； (2) 向酶联板中加入抗体稀释液，孵育，倾去包被液，用洗涤液洗涤，拍干； (3) 向酶联板的每孔中加入封闭液，孵育，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保 存； 所述包被缓冲液为PH8. 5-10的碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为含有2-6%的吐温-20的 去离子水；所述封闭液为含有5%-15%的脱脂奶和0. 1%-2. 5%的人血清白蛋白溶液。
4. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的终止液为3%盐酸缓冲液；
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的浓缩复溶液为1%牛血清白 蛋白的磷酸盐缓冲液。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗CK-MB抗体包被的酶联板的 制作方法中所述的包被缓冲液为PH9的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含有5%的吐温-20 的去离子水；所述的封闭液为含有10%的脱脂奶和1%的人血清白蛋白溶液。
6. -种检测阿司匹林和氯吡咯雷药物抵抗的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包 括： (1) CK-MB抗体包被的酶联板； (2) 酶标记CK-MB特异性抗体：采用辣根过氧化物酶标记； (3) CK-MB标准溶液： (4) 底物显色液：四甲基联苯胺； (5) 终止液：3%盐酸缓冲液； (6) 浓缩洗涤液：去离子水； (7) 浓缩复溶液：1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液； 所述CK-MB抗体为单克隆抗体；所述的单克隆抗体的制备方法包括： (1) 采用6~8周龄Balb/c小鼠作为免疫动物，CK-MB纯化蛋白免疫原免疫剂量为 5(Γ80 μ g/只，首次免疫时将免疫原于等量的弗氏佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，间 隔2~3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，免疫完成7天 后取脾细胞； (2) 细胞融合与克隆：将脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按照5 :1混合，采用HAT培养基筛 选杂交瘤细胞，然后将阳性细胞扩大培养，产生分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去 除细胞及其碎片； (3) 抗体在37°C下做冻干处理，放入-20°C冷藏； 所述的CK-MB抗体包被的酶联板的制作方法包括： (1) 用包被缓冲液将抗CK-MB抗体稀释为0. 01~0. 05 μ g/ml浓度的抗体稀释液； (2) 向酶联板中加入抗体稀释液，孵育，倾去包被液，用洗涤液洗涤，拍干； (3) 向酶联板的每孔中加入封闭液，孵育，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保 存； 所述包被缓冲液为PH9的碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为含有5%的吐温-20的去离子 水；所述封闭液为含有10%的脱脂奶和1%的人血清白蛋白溶液。
【文档编号】G01N33/543GK104237505SQ201410473417
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】吴晓星, 宋艳绒, 陈文珍, 杨军 申请人:杭州特马赛生物技术有限公司