基于络合作用与在线扫集技术的毛细管电泳直接紫外法快速检测Amadori化合物的制作方法
【专利摘要】基于络合作用与在线扫集技术的毛细管电泳直接紫外法快速检测Amadori化合物。本发明涉及到对番茄制品、干制果品、烟草等食品中Amadori化合物的检测，以进一步指导食品加工。方法利用Amadori化合物与Cu2+形成稳定络合物，而该络合物具有比Amadori化合物本身更强的紫外吸收、波长红移的特性，结合Amadori化合物-Cu2+络合能力以及荷质比不同提供毛细管电泳分离的动力，利用毛细管电泳的在线扫集技术进一步提高检测的灵敏度和检测限，可用于番茄制品如番茄粉、干果如葡萄干、烟草中Amadori化合物的检测。本发明的突出优点在于无需对样品中的Amadori化合物衍生化处理，操作方便，能够在30min的较短时间内实现Amadori化合物的有效分离、测定，具有较高的灵敏度、检测限，高效便捷，可靠性强。
【专利说明】基于络合作用与在线扫集技术的毛细管电泳直接紫外法快速检测Amador i化合物
【技术领域】
[0001]基于络合作用与在线扫集技术的毛细管电泳直接紫外法快速检测Amadori化合物。本发明涉及到对番茄制品、干制果品、烟草等食品中Amadori化合物的检测，以进一步指导食品加工。方法利用Amadori化合物与Cu2+形成稳定络合物，而该络合物具有比Amadori化合物本身更强的紫外吸收、波长红移的特性，结合Amadori化合物-Cu2+络合能力以及荷质比不同提供毛细管电泳分离的动力，利用毛细管电泳的在线扫集技术进一步提高检测的灵敏度和检测限，可用于番茄制品如番茄粉、干果如葡萄干、烟草中Amadori化合物的检测。属于仪器分析和食品加工领域。
【背景技术】
[0002]Amadori化合物是美拉德反应的初级产物。食品热加工过程中，葡萄糖、果糖等还原糖作为羰基供体，与氨基酸、肽、蛋白质中含有的自由氨基之间发生糖胺缩合反应，经
Amadori重排后，形成结构、性质相对稳定的中间产物-1_氨基_1_脱氧_2_酮糖，即
Amadori 化合物，其通用表达方式为 Fructose Amino acid,包括 FruGlu、FruPca、FruHis、FruPhe、FruLeu、FruIle、FruAla等。Amadori化合物的含量对生产中控制产品营养、色泽、风味等产品质量，改善工艺具有重要意义，尤其是在番茄制品、干果制品、烟草等的加工中。
[0003]由于Amadori化合物对番爺制品、烟草产品的质量有非常大的影响，建立一种快速、高效的测定Amadori化合物的方法非常重要。但目前对Amadori化合物的检测方法主要有利用不同检测器(示差折光检测器RID、紫外检测器UV、蒸发光散射检测器ELSD、质谱检测器MS)、不同固定相的高效液相色谱法；利用电化学检测器(ECD)或者二极管阵列检测器(PDA)、质谱检测器(MS)的高效离子交换色谱法(HPAEC)以及利用紫外可见检测器(UV)、荧光检测器(FL)和质谱检测器(MS)的毛细管电泳法。而这些现有的方法各有其缺点和局限性:高效液相色谱法需要耗时的清洗柱子的过程，并且利用常规的反相柱，不能将结构相似的多种Amadori化合物有效的分开；高效离子交换色谱法只对一部分Amadori化合物有良好的分离检测能力，不适用于分析复杂体系，另外部分Amadori化合物会在离子交换柱上发生分解；而毛细管电泳检测主要是利用紫外或荧光检测器，但由于大多数Amadori化合物有很弱的或者没有紫外可见光吸收和荧光产生，因此利用紫外或荧光检测器的毛细管电泳检测Amadori化合物往往需要衍生化处理，衍生化过程复杂且耗时，同时利用质谱检测器的毛细管电泳由于设备昂贵，并没有广泛被使用。
[0004]研究表明，路易斯酸和路易斯碱的相互作用能提供毛细管电泳分离的动力。许多有机化合物含有大量的O和N原子，能够提供孤对电子，从而与Cu2+发生相互作用，形成络合物(J.Sep.Sc1.2009，32，1927-1933 ；J.Anal.Chem.2006，34，1219-1222 ；J.Am.Chem.Soc.2000,122,3787-3788)。比如 Amadori 化合物就能与 Cu2+ 形成络合物(InorganicaChimica Acta 214(1993)57-66 ；J.Agric.Food Chem.2007,55,10373-10381 ；InorganicaChimica Acta 413(2014)45-54)。不同Amadori化合物与Cu2+的不同络合能力以及荷质比提供分离的动力。更为重要的是Cu2+与Amadori化合物的络合作用所引起的电荷转移跃迁使得络合物的紫外吸收波长红移，在260nm左右有很强的紫外吸收，这也大大提高了检测的灵敏度，使得定量成为可能。
[0005]毛细管电泳的在线扫集技术:样品区的自由态的分析物A带很少电量或者不带电，因此其有效迁移率很小，在施加电压后，Mn+即Cu2+有很大的有效迁移率，因此能够很快的进入样品区SZ，进一步与Amadori化合物形成络合物，并且络合物的迁移率远远大于A，从而样品区分析物浓度能进一步提高(J.Sep.Sc1.2009，32，1927-1933)。
[0006]本发明利用Amadori化合物与Cu2+形成稳定络合物,而该络合物具有比Amadori化合物本身更强的的紫外吸收、波长红移的特性，结合毛细管电泳的在线扫集技术进一步提高检测的灵敏度和检测限，可用于番茄制品、干果制品、烟草等食品中Amadori化合物的快速检测。
【发明内容】
[0007]针对现有检测技术所存在的不足，本发明集合了络合作用与在线扫集技术，提供一种快速、准确测定番茄制品、干果制品、烟草等食品中Amadori化合物含量的方法，以便进一步指导食品的加工。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:基于络合作用与在线扫集技术的毛细管电泳直接紫外法快速检测Amadori化合物。包括以下步骤:
[0009]①单标准溶液配制:标准固体样品自制(通过LC-MS和NMR验证纯度)或者购于TRC公司，然后分别称取适量的各种Amadori化合物，分别配成10ml的标准水溶液，浓度均为1.0X10_3mol/L，4°C下储藏并且避光(3天之内使用)。
[0010]②混合标准溶液配制:分别移取各单标准溶液5ml于50ml的容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到浓度为1.0 X 10_4mol/L，4°C下储藏并且避光(3天之内使用)，通过混合标准溶液优化毛细管电泳条件(见步骤⑤)。
[0011]③标准曲线的绘制:分别吸取适量的单标准样品溶液，配成5ml浓度分别为0.5Xl(T4mol/L、0.25X l(T4mol/L、0.2X l(T4mol/L、0.lXl(T4mol/L 的标准样品溶液，在步骤②优化条件的基础上，进行毛细管电泳检测，每个样品测定5次，记录出峰时间，同时以峰高为横坐标，Amadori化合物浓度为纵坐标，进行回归分析得到标准曲线、线性范围、相关系数
[0012]④样品萃取:将番茄粉或者番茄酱添加到去离子水中，搅拌一段时间后，混合物进行冷冻离心，上清液用PVDF注射过滤器进行过滤，制得试样。或者将烟草样品粉碎，以体积浓度为60%甲醇/水溶液萃取，过滤，收集滤液，滤液中加入正己烷萃取2-5次，除去色素等杂质，再将甲醇/水相浓缩至干，用去离子水定容后，用PVDF注射过滤器进行过滤，制得试样。
[0013]⑤样品测定:基于络合作用与在线扫集技术的毛细管电泳直接紫外法快速检测Amadori化合物:检测波长260nm,进样量0.5psi X 5.0sec,电泳温度20°C,分离电压23KV,缓冲溶液为35mM CuSO4水溶液，用0.05%乙酸进行PH调节，缓冲溶液PH4.26，仪器具体操作要求⑤如下:
[0014]使用贝克曼库尔特商贸有限公司的P/ACE MDQ毛细管电泳系统，首次分析前用lmol/L氢氧化钠溶液润洗lOmin，等待5min，然后依次用去离子水、缓冲溶液各润洗lOmin。每分析I小时，小瓶中的缓冲溶液换成新的缓冲溶液，并且清理掉电极上析出的金属杂质，同时二次进样间隙用新缓冲溶液润洗毛细管5min。
[0015]本发明的有益效果
[0016]本发明的突出优点在于无需对样品中的Amadori化合物衍生化处理，操作方便，能够在30min的较短时间内实现Amadori化合物的有效分离、测定,具有较高的灵敏度、检测限，高效便捷，可靠性强。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为络合作用扫集示意图，图中(a)代表施加电压以前的状态，(b)代表施加电压后的状态；sz代表样品区域；BGS代表背景缓冲液。A代表自由态的分析物，Amadori化合物；Mn+代表缓冲液中的过渡金属离子，Cu2+
[0018]图2为实施例1所得的在260nm处毛细管电泳检测图，可以看到峰与峰之间能明显的分开。
[0019]图3为混合标准溶液(仅以FruGlu、FruLeu与FruPCA)与实施例1在260nm处毛细管电泳检测图的对照图。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
[0021]①单标准溶液配制:标准固体样品自制(通过LC-MS和NMR验证纯度)或者购于TRC公司，然后分别称取适量的各种Amadori化合物，分别配成10ml的标准水溶液，浓度均为1.0X10-3mol/L，4°C下储藏并且避光(3天之内使用)。
[0022]②混合标准溶液配制:分别移取各单标准溶液5ml于50ml的容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到浓度为1.0X10-4mol/L，4°C下储藏并且避光(3天之内使用)，通过混合标准溶液优化毛细管电泳条件。
[0023]③标准曲线的绘制:分别吸取适量的单标准样品溶液，配成5ml浓度分别为0.5X10-4mol/L、0.25 X 10_4mol/L、0.2 X 10_4mol/L、0.lX10_4mol/L 的标准样品溶液，在步骤②优化条件的基础上，进行毛细管电泳检测，每个样品测定5次，记录出峰时间，同时以峰高为横坐标，Amadori化合物浓度为纵坐标，进行回归分析得到标准曲线、线性范围、相关系数。
[0024]④样品萃取:将3.0g番茄粉或者9.0g番茄酱添加到20ml去离子水中，搅拌30min之后,混合物在4°C、80000rpm下进行冷冻离心30min，上清液放在盛有50ml去离子水中透析24h，透过液冷冻干燥3天，制的固体试样，_18°C保藏。测定前，固体样品用去离子水溶解，并定容到10ml，用PVDF注射过滤器进行过滤。
[0025]⑤样品测定:基于络合作用与在线扫集技术的毛细管电泳直接紫外法快速检测Amadori化合物，操作条件如同以上技术方案。
[0026]实施例2
[0027]①单标准溶液配制:标准固体样品自制(通过LC-MS和NMR验证纯度)或者购于TRC公司，然后分别称取适量的各种Amadori化合物，分别配成10ml的标准水溶液，浓度均为1.0X10-3mol/L，4°C下储藏并且避光(3天之内使用)。
[0028]②混合标准溶液配制:分别移取各单标准溶液5ml于50ml的容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到浓度为1.0X10-4mol/L，4°C下储藏并且避光(3天之内使用)，通过混合标准溶液优化毛细管电泳条件
[0029]③标准曲线的绘制:分别吸取适量的单标准样品溶液，配成5ml浓度分别为0.5X10-4mol/L、0.25 X 10_4mol/L、0.2 X 10_4mol/L、0.lX10_4mol/L 的标准样品溶液，在步骤②优化条件的基础上，进行毛细管电泳检测，每个样品测定5次，记录出峰时间，同时以峰高为横坐标，Amadori化合物浓度为纵坐标，进行回归
[0030]④样品萃取:将烟叶样品粉碎，过80目筛，称取3.0g样品，置于具塞锥形瓶中，力口入50mL甲醇/水溶液(体积分数60%)萃取，过滤，收集滤液，滤液中加入50mL正己烷萃取
2-5次，除去色素等杂质，再将甲醇/水相浓缩至干，用去离子水溶液定容到10ml，用PVDF注射过滤器进行过滤，制得试样。
[0031]⑤样品测定:基于络合作用与在线扫集技术的毛细管电泳直接紫外法快速检测Amadori化合物，操作条件如同以上技术方案。
【权利要求】
1.基于络合作用与在线扫集技术的毛细管电泳直接紫外法快速检测Amadori化合物。其特征在于结合Amadori化合物-Cu2+络合能力以及荷质比不同提供毛细管电泳分离的动力，利用毛细管电泳的在线扫集技术进一步提高检测的灵敏度和检测限，无需对Amadori化合物进行衍生化处理就能在较高波长利用紫外检测器直接进行检测。
2.根据权利要求1的Amadori化合物的方法，其特征在于可一次性检测以下(但不限于以下)Amadori 化合物:FruGlu、FruPca、FruHis、FruPhe,FruLeu 和 Frulle。具体检测参数:检测波长260nm，进样量0.5psiX5.0sec,电泳温度20°C，分离电压23KV，缓冲溶液为35mM CuSO4水溶液，用0.05%乙酸进行pH调节，缓冲溶液pH4.26。
3.根据权利要求1所述，“食品”指广义的食品，含有Amadori化合物的物质经过适当的前处理均能利用该方法进行检测，不单单指这里提到的番茄制品、干果制品和烟草。
4.根据权利要求1所述，“Cu2+”代表过渡金属中某些特定种类的离子，广义上包括能与Amadori化合物形成稳定络合物，并且络合物在较高波长处有一定强度的紫外吸收，比如Fe3+、Ni2+、pt2+，不单单仅指这里提到的Cu2+。
5.根据权利要求2所述，“检测参数”针对具体的检测对象、前处理条件以及设备条件进行适当调整和优化，尤其是缓冲液的浓度、PH根据检测实际情况进行优化，不是固定不变的。
【文档编号】G01N27/447GK104297326SQ201410554460
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】张连富, 余佳浩 申请人:江南大学