斑马鱼在检测bbp生殖毒性中的应用及快速检测bbp生殖毒性的方法
【专利摘要】本发明生物【技术领域】，涉及一种检测邻苯二甲酸丁基苄酯（ButylbenzylPhthalate，BBP)的生殖毒性检测方法。具体涉及一种利用模式生物斑马鱼检测BBP生殖毒性检测方法。更具体的是涉及利用成体斑马鱼快速检测BBP对雄性生精能力和雌性产卵能力的方法。本发明的方法经实验结果显示，检测周期只需8天，短于现有文献报道的其它方法；检测BBP的生殖毒性的最低浓度为0.6mg.L-1优于其它方法的检测浓度。
【专利说明】斑马鱼在检测BBP生殖毒性中的应用及快速检测BBP生殖 毒性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了斑马鱼在检测BBP生殖毒性中的应用及快速检测BBP生殖毒性的方 法。
【背景技术】
[0002] I) BBP 邻苯二甲酸酯（PAEs)是一种广泛使用的聚氯乙烯增塑剂类化合物。近年来，发现它也 是一类潜在的环境内分泌干扰物。作为增塑剂，由于PAEs与塑料主体结构之间不以化学键 相结合，在使用过程中会不断从塑料中释放出来，污染环境。美国人类生殖危险评估中心 (CERHR)通过综合评定提出与人类健康密切相关的9种PAEs，BBP就是其中的一种。目前 的检测BBP类增塑剂的方法GC-MS、液相色谱-质谱联用（HPLC-MS)，方法虽然基本可以满 足常规检测要求，但是各种前处理手段繁琐，成本高昂，需要专业人员和专业设备较多而且 该方法需要样品纯度高(不能检测环境中BBP)，所以应当探索前处理耗用成本低，灵敏度、 重现性及易操作性均好的方法。研究还发现，BBP是具有明显雌激素生物效应的8种酞酸酯 类中的一种，其应用广泛、难以降解成为备受关注的全球性环境污染物之一。邻苯二甲酸丁 基苄酯（BBP)分子式为C 19H2OO4，分子量312. 3。由于BBP在相关的产品中呈游离状态，因此 可转移进入环境从而对大气、土壤、水体造成严重污染，并通过食物、呼吸、饮水和皮肤接触 等各种途径进入人体，造成危害。BBP急性毒性较低，但较高剂量下易引起动物生殖系统。
[0003] 2)生殖毒性 指外来物质对雌性和雄性生殖系统，包括排卵、生精，从生殖细胞分化到整个细胞发 育，也包括对胚胎细胞发育所致的损害，引起生化功能和结构的变化，影响繁殖能力，甚至 累及后代。环境内分泌干扰物的污染及其对人类生育功能的危害，已经成为当今环境医学 关注的热点，也直接关系着人类和自然的可持续发展。BBP作为一种环境污染物对生物生 殖系统所造成的损害不容忽视。迄今为止，较多研究关注了 BBP雄性生殖毒性。在胚胎期， 生殖系统对BBP毒性比较敏感，因为胚胎期是人体各器官发育的重要时期。动物实验表明， 胚胎期或者哺乳期暴露高剂量的BBP (>250 mg/d)会导致明显的生殖发育毒性包括：隐睾、 尿道下裂、附属性腺萎缩及发育不全、睾丸损伤、精子生成减少、青春期发育推迟、肛殖距减 小。
[0004] 3)斑马鱼 斑马鱼（Zebrafish, Danio rerio)是近年来应用越来越广泛的重要模式生物。斑马鱼 是一种脊椎动物，与人类基因同源性高，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理 功能与哺乳动物高度相似，具有饲养成本低、体积小、发育周期短、体外受精、透明易观察、 单次产卵数较高等特点。而与线虫和果蝇这样的模式生物相比，虽然后者也可用于大规模 筛选，但并不能阐明高等生物特有的组织或器官发育和功能。目前，已有一系列论文报道影 响斑马鱼胚胎发育的突变体的筛选及鉴定，揭开了斑马鱼广泛应用于与发育和疾病相关的 基因功能分析的序幕。因此近年来斑马鱼已经发展成为人类疾病和毒理学研究得的良好的 动物模型目前斑马鱼已被美国国家卫生研究院（NIH)列为继人和小鼠之后的第三大模式生 物。目前，在美国及欧洲共有2000多家机构从事斑马鱼相关技术的基础和应用基础研究， 并有9家斑马鱼新药筛选公司向全球范围提供商业化服务。近几年来，欧洲经济与合作发 展组织（OE⑶）和日本的生殖毒理学家就采用斑马鱼作为检测水环境内分泌干扰物浓度的 早期敏感对象，并取得积极成果。中国也已在2011将斑马鱼技术列入"重大新药创制专项" 十二五计划。
[0005] 4)毒理学检测模型 在毒理研究中，实验模型的选择一直是个难题，普通的动物模型如大鼠和小鼠存在着 生长周期较长（8周以上)，检测指标不确定，灵敏度差，样品纯度高且难以大规模研究等缺 点，而单纯的细胞材料又很难再现体内的实际情况。斑马鱼模型现已广泛应用于包括急 性毒性、发育毒性与致畸性、胚胎毒性、心血管毒性、肝毒性、神经毒性、肾毒性、行为毒性 和生殖毒性等在内的一系列药物毒性评价中。2009年欧洲斑马鱼药物筛选技术服务公司 Biobide (www. biobide, es)获得了美国食品与药品管理局（FDA)和欧洲药品评估局（EMEA) 的GLP认证，标志着斑马鱼药物毒理学与安全性评价模型已经得到了欧美国家政府的正式 认可。2013年4月8号，美国FDA在其官网刊文报道斑马鱼在药物早期毒性评价中的作用。 斑马鱼的基因与人类基因相似度达到87%，这意味着在它身上得出的水质监测结果，多数情 况下都适用于人类。
[0006] 斑马鱼模型检测化合物毒理学案例中。用化合物处理斑马鱼，可观察到斑马鱼一 系列的特异的组织器官发育异常，结合半致死率评价方法，并与哺乳动物的致畸作用进行 比较，这样就可以对化合物毒性获得较为准确的评估。数据显示，斑马鱼药物评价系统识别 非致畸物质成功率为75%，识别致畸物质成功率则高达100%。该评价系统的特异性（709T 80%)和敏感性（>80%)非常突出，优于小鼠或者大鼠等常规实验动物。报道还表明，阿斯利 康等5家跨国医药巨头已经用斑马鱼进行先导化合物早期发育毒性评价，涉及了 58种遴选 的化合物(不包括BBP)，整体的预测准确定超过80%，具有很高的可靠性和灵敏度。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种低成本的快速检测二甲酸丁基苄酯生殖毒性的方法，更 具体的，本发明涉及利用模式生物斑马鱼来快速检测二甲酸丁基苄酯生殖毒性。
[0008] 模式生物斑马鱼在检测BBP生殖毒性中的应用，其是采用成体斑马鱼快速检测 BBP对雄性斑马鱼生精能力、对雌性斑马鱼产卵能力。
[0009] 一种快速检测BBP生殖毒性的方法，包括下述步骤： 1) 斑马鱼的饲养； 2) 将性成熟斑马鱼转移进行BBP暴露，然后检测BBP对于斑马鱼7天的急毒效应，求得 BBP对斑马鱼7天的LC50 ; 3) 检测BBP的生殖毒性，包括BBP对雄性斑马鱼精子生成能力的影响和BBP对雌性斑 马鱼产卵能力的影响。
[0010] 步骤1)采用AB系野生型斑马鱼作为实验对象，饲养4-6个月。
[0011] 步骤2)进行BBP暴露时的BBP浓度为0-5mg. L-1之间。
[0012] 本发明生物【技术领域】，涉及一种检测邻苯二甲酸丁基节酯（Butyl benzyl Phthalate，BBP)的生殖毒性检测方法。具体涉及一种利用模式生物斑马鱼检测BBP生殖 毒性检测方法。更具体的是涉及利用成体斑马鱼快速检测BBP对雄性生精能力和雌性产卵 能力的方法。本发明采用模式生物斑马鱼来快速检测BBP生殖毒性，检测周期只需8天， 短于现有文献报道的其它方法；检测BBP的浓度范围在0. 6-2. 96 mg. I71之间，最优区间 0. 6-1. 5mg. L'检测BBP的生殖毒性的最低浓度为0. 6 mg. I71，优于其它方法的检测浓度； 检测一份样品的BBP成本测算低于50元/次，低于其它方法成本。本发明在利用AB斑马 鱼检测BBP生殖毒性技术中，检测BBP的浓度范围在0. 6-2. 96 mg. I71之间，低于此浓度检 测灵敏度受影响，而超过此浓度则会引起实验斑马鱼的死亡。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为BBP对于雄性斑马鱼精子产生的影响。
[0014] 图2为BBP对于雌性斑马鱼产卵的影响。
[0015] 图3为斑马鱼置换实验BBP对于斑马鱼交配的影响。
[0016] 图4为斑马鱼置换实验BBP对于斑马鱼交配的影响。
【具体实施方式】
[0017] 下述实施例是对于本
【发明内容】
的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但 本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任 何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
[0018] 实施例1 1.斑马鱼的饲养：1) AB系野生型斑马鱼购自美国俄勒冈州立大学（Oregon State University，OR. USA)国际斑马鱼中心。成年斑马鱼饲养于2. 5 L的鱼缸中，循环的系统 水流经过鱼缸。每天成年斑马鱼给予盐水小奸（brine shrimp)喂食2次。盐水小奸由人 工合成的海水孵化。在小鱼出生后2 - 16天，给予幼鱼人工饲料Hatchfry EncapsulonTM (Argent Chemical Laboratories, Redmond, WA, USA) ?喂食。鱼房恒温 28.5 °C，光照和 熄灯的时间为14:10小时；2)自来水经过活性碳过滤并经由反向渗透装置处理获得纯化 水，而后在其中添加分析纯度的天然盐以合成符合美国环保署标准（U. S. Environmental Protection Agency Guideline, U.S. EPA, 1986)的淡水。合成的淡水经过充氧，以 9 L/天的流速供应给每个鱼缸。自动监测仪（YSI 5200 Recirculating System Monitor, Aquatic Habitats，FL，USA)持续监测系统水的温度（28°C)，pH值（6. 9-7. 3)，电导率 (240)，溶氧（6ppm)及氨浓度（小于2.0mg/L)等指标(按斑马鱼操作手册)。斑马鱼性成熟 后，进行生殖毒性的检测。
[0019] 2.检测BBP对于斑马鱼7天的急毒效应：按照周永欣和章宗涉（1989)的方法进 行鱼类急性毒性实验。将性成熟斑马鱼转移到I L的鱼缸中开始BBP暴露。暴露的剂量为 0. 00, 2. 45, 2. 75, 3. 05, 3. 35, 3. 65及3. 95 mg. L'每个鱼缸中随机放入20条鱼，每组有3 个鱼缸。每24小时用新配置的BBP溶液换水一次。定时观察鱼的中毒症状并及时将死鱼 捞出，记录鱼的死亡数量。BBP对斑马鱼7天急性半致死试验结果如表1所示。从表1中可 以看出7天内随着BBP浓度的升高斑马鱼死亡率也随着升高。用SPSS13.0软件求得BBP 对斑马鱼7天LC50为2. 96 mg. L'
[0020] 表I、BBP对斑马鱼7天急性毒性实验
【权利要求】
1. 斑马鱼在检测BBP生殖毒性中的应用，其是采用成体斑马鱼快速检测BBP对雄性斑 马鱼生精能力、对雌性斑马鱼产卵能力。
2. -种快速检测BBP生殖毒性的方法，其特征在于，包括下述步骤： 1) 斑马鱼的饲养； 2) 将性成熟斑马鱼转移进行BBP暴露，然后检测BBP对于斑马鱼7天的急毒效应，求得 BBP对斑马鱼7天的LC50 ; 3) 检测BBP的生殖毒性，包括BBP对雄性斑马鱼精子生成能力的影响和BBP对雌性斑 马鱼产卵能力的影响。
3. 如权利要求2所述快速检测BBP生殖毒性的方法，其特征在于，步骤1)采用AB系野 生型斑马鱼作为实验对象，饲养4-6个月。
4. 如权利要求2所述快速检测BBP生殖毒性的方法，其特征在于，步骤2)进行BBP暴 露时的BBP浓度为0-5mg. L-1之间。
【文档编号】G01N33/00GK104374883SQ201410684262
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】豆长明, 张洁, 齐翠翠, 潘成荣, 王军, 杨远盛, 聂天琛 申请人:安徽省环境科学研究院