猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸。该试纸包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗原及抗体区和吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗原抗体区和吸水区铺设在支撑板上并依次相互部分重叠；金标探针区包被胶体金标记的小鼠抗猪IgM单抗；固相化抗原及抗体区上有检测线T1、T2和对照线C，检测线T1、T2分别包被猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪蓝耳病毒N蛋白，对照线C包被羊抗小鼠IgG抗体。本实用新型检测快速，准确率高、特异性强，携带、操作方便，可同时检测猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体，适合早期感染检测；其常温下即可保存，保存期达2年，且检测重复性好。
【专利说明】猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸
【技术领域】
[0001]本实用新型属于兽用疫病检测【技术领域】，具体涉及一种猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原，该病主要以患畜生长缓慢、进行性消瘦和多系统病例损伤为特征。除了引发PMWS外，PCV2还与仔猪先天性震颤、猪皮炎肾炎综合征、猪呼吸道综合征、母猪繁殖障碍等疾病相关。PCV基因组由一条共价闭合环状单股DNA构成，包含两个大的开放阅读框架ORFl和0RF2，分别编码病毒蛋白复制酶(Rep)和病毒衣壳蛋白(Cap)。Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白，含有4个抗原表位，具有较好的免疫原性和抗原性，是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原。检测PCV2的衣壳蛋白抗体可以反映PCV2的抗体水平，对猪群PCV2抗体水平进行监测，可确切了解猪体免疫水平或感染状况，制定最适免疫程序或淘汰选育，有效预防和控制PCV2的侵袭和传播，避免因此而引起的重大经济损失。
[0003]猪蓝耳病，即猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome，PRRS )是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV )引起的一种严重危害养猪业的传染病。该病以怀孕母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪呼吸困难、高死亡率和育肥猪呼吸异常为特征，也称“猪不孕与流产综合征”。PRRSV现已遍布于全世界主要养猪国家和地区，已经成为威胁养猪业健康发展的主要疫病之一。PRRSV是动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的单股正链RNA病毒。其全基因组长约15kb，含有9个开放阅读框(ORFs)。其中，N蛋白也称核衣壳蛋白，约15kD，由0RF7编码，在病毒粒子中含量较高，N基因高度保守。N蛋白之间形成同源二聚体，对病毒的组装至关重要，可以诱导机体产生细胞免疫作用。是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原。
[0004]胶体金免疫层析方法是一种很成熟的实验检测方法，以其特异性强、成本低，操作简便，结果可靠、可单份或成批测定、不需任何仪器等优点已被广泛接受。国内有相关圆环和蓝耳的胶体金检测试纸的研究报道，但是都限于检测IgG抗体，不能检测其早期感染情况。猪圆环病毒和猪蓝耳病毒IgM抗体的检测对相关疫苗效果的评价和动物疫病流行病的检测与调查具有重要意义。
实用新型内容
[0005]本实用新型的目的是为了提供一种快速、有效、同时检测猪圆环病毒IgM抗体和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸。
[0006]为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案:
[0007]猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸，包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗原及抗体区和吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗原抗体区和吸水区铺设在支撑板上并依次相互部分重叠；所述的金标探针区包被有胶体金标记的小鼠抗猪IgM单克隆抗体,标计量优选为每mL胶体金标记5~20Pg小鼠抗猪IgM单抗,金标探针包被量优选为5~15μL ;所述的固相化抗原及抗体区上有检测线Tl、检测线Τ2和对照线C，对照线C靠近吸水区；所述的检测线Tl和检测线Τ2分别包被猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪蓝耳病毒N蛋白，对照线C包被羊抗小鼠IgG纯化抗体；猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪蓝耳病毒N蛋白的包被量均优选为0.5~5Pg，羊抗小鼠IgG纯化抗体的包被量优选为I~lOgg。
[0008]所述的支撑板的材料优选为粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板；所述的样品吸收区的材料优选为玻璃纤维膜；所述的金标探针区的材料优选为聚酯膜；所述的固相化抗原和抗体区的材料优选为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料优选为吸水滤纸。
[0009]上述的猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪蓝耳病毒N蛋白均为高纯度的杆状病毒表达蛋白，可按照本领域常规技术制备或购买市售产品均可。
[0010]上述的小鼠抗猪IgM单克隆抗体可按照本领域常规技术制备或购买市售产品均可。
[0011]本实用新型采用胶体金免疫层析间接法，将胶体金标记的小鼠抗猪IgM单克隆抗体包被在聚酯膜上，可与待检样品中的猪IgM抗体形成“金-二抗-抗体”复合物；将猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪蓝耳病毒N蛋白分别包被到两条检测线，能分别捕获特异的猪抗体，形成“金-二抗-抗体-抗原”复合物；羊抗小鼠IgG纯化抗体包被到质控线作对照用。对照线出现红色，表明试纸有效，如果待检样品中含有相应的抗体，检测线会分别显红色，反之，检测线不显色。
[0012]本实用新型的试纸具有以下优点:
[0013]检测时，抽取被测者少量血清，滴在该试纸上，对比检测线和对照线的颜色，即可判定被测者体内是否产生了猪圆环病毒2型抗体和(或)猪蓝耳病毒抗体。
[0014]1、检测快速:检测时间只需5-10分钟，能够满足现场检测的需要。
[0015]2、采用金标记小鼠抗猪IgM单克隆抗体作为捕获探针，可快速、同时检测猪圆环病毒2型IgM抗体和猪蓝耳病毒IgM抗体，与猪IgG无交叉。特别适合早期感染检测，可用于相关疫苗效果的评价和动物疫病流行病的检测与调查。
[0016]3、检测准确率高、特异性强。
[0017]4、携带方便，操作简便:本实用新型不需要借助其它仪器设备，适合各级兽医院、猪场及个人使用。
[0018]5、检测试纸在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器。保存期可达2年，且检测重复性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本实用新型的平面结构区域图，其中，1-样品吸收区，2-金标探针区，3-固相化抗原及抗体区，31-检测线Tl，32-检测线T2，33-对照线C，4-吸水区。
[0020]图2为本实用新型的纵切面结构图(用具体材料代表各个区域)，其中，5-粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板(支撑板)，6_玻璃纤维膜(样品吸收区)，7_聚酯膜(金标探针区)，8-硝酸纤维素膜(固相化抗原及抗体区)，9-吸水滤纸(吸水区)。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例及附图对本实用新型做进一步详细说明，但本实用新型的保护范围不限于此。
[0022]实施例1
[0023]猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸平面结构区域图如图1所示，试纸水平面自下而上依次为:样品吸收区1、金标探针区2、固相化抗原及抗体区3和吸水区4，固相化抗原及抗体区3包被有检测线Tl 31、检测线T2 32和对照线C33。
[0024]猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸纵切面结构图(用具体材料代表各个区域)如图2所示，粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板5为支撑板，玻璃纤维膜6为样品吸收区，聚酯膜7为金标探针区，硝酸纤维素膜8为固相化抗原及抗体区，吸水滤纸9为吸水区，聚酯膜7上包被有金标探针；玻璃纤维膜6、聚酯膜7、硝酸纤维素膜8、吸水滤纸9铺设在聚乙烯板5上并依次相互部分重叠。
[0025]金标探针为胶体金标记的小鼠抗猪IgM单克隆抗体,标记量为每mL胶体金标记5Pg单抗,金标探针包被量为?ομL ;检测线Tl 31包被的是猪圆环病毒2型Cap蛋白，包被量0.5μg ;检测线Τ2 32包被的是猪蓝耳病毒N蛋白，包被量0.5μg ;对照线C 33包被的是羊抗小鼠IgG纯化 抗体，包被量Mg。
[0026]上述猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸制备方法如下:
[0027](I)胶体金标记小鼠抗猪IgM单克隆抗体的方法:分别取半径为40nm浓度为
0.01%的胶体金20mL及小鼠抗猪IgM单克隆抗体lOOPg，在pH8.5的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)和聚乙二醇20000 (PEG20000)作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1%，PEG20000最终质量浓度为0.01%，采用离心法除去未结合的小鼠抗猪IgM单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金一小鼠抗猪IgM单克隆抗体复合物。
[0028](2)将胶体金标记的小鼠抗猪IgM单克隆抗体喷涂于聚酯膜上:用20mL含1%BSA的PBS (0.01M, pH 7.4)分别洗涤胶体金一小鼠抗猪IgM单克隆抗体复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2mL含1%BSA的PBS溶解，用喷涂设备分别涂于聚酯膜上，冻干。
[0029](3)硝酸纤维素膜的包被:在硝酸纤维素膜依次包被检测线Tl、检测线T2和对照线C ;检测线Tl包被的是猪圆环病毒2型Cap蛋白，包被量0.5μg,检测线T2包被的是猪蓝耳病毒N蛋白，包被量0.05μg,对照线C包被的是羊抗小鼠IgG抗体，包被量lPg，每条线宽I ~3mm。
[0030](4)试纸组装:用粘上一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板作为支撑载体，上面依次铺设玻璃纤维膜、金标探针的聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，外面用胶带包封后切成2~4mm宽的试纸制成。
[0031]实施例2:[0032]除检测线Tl包被量为5Pg ;检测线Tl包被量为5Pg，对照线C包被量为IOPg ;金标探针胶体金标记小鼠抗猪IgM单克隆抗体标记量为每mL胶体金标记20Pg抗体及金标探针包被量为5PL外，其余与实施例1相同。
[0033]实施例3
[0034] 除检测线Tl包被量为2Pg ;检测线Tl包被量为2Pg,对照线C包被量为5Pg ;金标探针胶体金标记小鼠抗猪IgM单克隆抗体标记量为每mL胶体金标记IOPg抗体及金标探针包被量为15μL外，其余与实施例1相同。
[0035]实施例4
[0036]猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸的使用方法及结果判定:检测时，抽取被测者少量血清样品，用PBS (0.01Μ, pH 7.4)稀释一倍，将该试纸的样品吸收区一端浸入稀释的样品中，5~10分钟后判读结果:对照线C出现红色，表示试纸有效；检测线Tl出现红色，表明猪圆环病毒2型IgM抗体阳性；检测线T2出现红色，表明猪蓝耳病毒IgM抗体阳性；检测线Tl和(或)T2无颜色出现，表明血清中猪圆环病毒2型IgM抗体和(或)猪蓝耳病毒IgM抗体阴性。
[0037]上述实施例为本实用新型较佳的实施方式，但本实用新型的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本实用新型的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本实用新型的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于:包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗原及抗体区和吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗原抗体区和吸水区铺设在支撑板上并依次相互部分重叠；所述的金标探针区包被有胶体金标记的小鼠抗猪IgM单克隆抗体；所述的固相化抗原及抗体区上有检测线Tl、检测线T2和对照线C，对照线C靠近吸水区；所述的检测线Tl和检测线T2分别包被猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪蓝耳病毒N蛋白，对照线C包被羊抗小鼠IgG纯化抗体。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于:所述的胶体金标记的小鼠抗猪IgM单克隆的标计量为每mL胶体金标记5~2(^g小鼠抗猪IgM单抗，胶体金标记的小鼠抗猪IgM单克隆的包被量为5~15μL。
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于:所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪蓝耳病毒N蛋白的包被量为0.5 ~5I^gο
4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于:所述的羊抗小鼠IgG纯化抗体的包被量为I~l(^g。
5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型和猪蓝耳病毒IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于:所述的支撑板的材料为粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板；所述的样品吸收区的材料为 玻璃纤维膜；所述的金标探针区的材料为聚酯膜；所述的固相化抗原和抗体区的材料为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料为吸水滤纸。
【文档编号】G01N33/577GK203772871SQ201420110224
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】廖园园, 漆世华, 秦伟, 朱薇, 李建, 刘洁, 谢红玲, 温文生, 冯钊 申请人:武汉中博生物股份有限公司