本发明涉及食品快速检测
技术领域：
，特别涉及一种复合电极及检测河豚毒素含量的方法。
背景技术：
：河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种低分子量的海洋生物神经性毒素，存在于多种生物体内。河豚毒素是一种典型的钠离子通道抑制剂并且是小分子蛋白的稳定性麻痹毒素，是自然界中非蛋白质的最毒性物质之一，河豚毒素因其高毒性和在海鲜中的累积对人类健康是致命的。动物实验中，静脉注射和皮下注河豚毒素的半数致死剂量分别为2～10μgkg-1和10～14μgkg-1。因此，很有必要来开发一种分析方法来检测河豚毒素，从而支持海鲜市场的监控。现有技术中已有很多河豚毒素的检测方法，包括小鼠生物法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱连用法。其中，小鼠生物法主要根据小鼠死亡时间来推断河豚毒素的含量，即通过给小鼠投喂不同浓度的河豚毒素，观察其死亡时间，从而推断河豚毒素的含量。现有的河豚毒素检测方法虽然能够基本准确的检测出河豚毒素的含量，但是检测时间太长。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种复合电极及检测河豚毒素含量的方法。本发明提供的检测方法能够在20分钟以内检出样品中河豚毒素的含量，实现快速检测。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种复合电极，包含电活性物质盛放容器、置于所述容器内的离子液体和单壁碳纳米管的混合物以及部分伸入所述混合物内部的导线。优选的，所述离子液体和单壁碳纳米管的质量比为(93～97):(3～7)。本发明提供了一种所述复合电极的制备方法，包括以下步骤：将包含离子液体和单壁碳纳米管的混合物填满所述容器内部，然后进行加热处理；将导线的一端插入所述混合物中，得到所述复合电极。优选的，所述加热处理的温度为85～95℃；所述加热处理的时间为1～5分钟。本发明还提供了一种所述复合电极检测河豚毒素含量的方法，包括以下步骤：提供待检测样品；以所述复合电极为工作电极，采用电化学间接酶联免疫的方法对待检测样品进行检测，得到电流差值；根据所述电流差值计算得到待检测样品中河豚毒素的含量。优选的，所述检测采用三电极体系，具体为工作电极、参比电极和对电极。优选的，所述参比电极为氯化银参比电极。优选的，所述对电极为铂丝。优选的，所述电化学方法为安培时间法。优选的，所述安培时间法的电位为+0.7～+0.8V，扫描速率为0.01～0.02V/s。本发明提供了一种复合电极及检测河豚毒素含量的方法。本发明复合电极，包含电活性物质盛放容器、置于所述容器内的离子液体和单壁碳纳米管的混合物以及部分伸入所述混合物内部的导线。本发明以所述复合电极为工作电极，采用电化学间接酶联免疫的方法对待检测样品进行检测，得到待检测样品中河豚毒素的含量。根据实施例的实验结果可知，本发明提供的检测方法将电化学和免疫学相结合，能够在20分钟以内测定待测样品中的河豚毒素的实际含量。此外，本申请提供的电化学方法与光学法的检测结果基本一致，证明本申请提供的检测方法具有较高的准确度。具体实施方式本发明提供了一种复合电极，包含电活性物质盛放容器、置于所述容器内的离子液体和单壁碳纳米管的混合物以及部分伸入所述混合物内部的导线。本发明提供的复合电极包括盛放电活性物质的容器。本发明对所述容器的材质、尺寸没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的能够用于电化学检测的电极容器即可。在本发明中，所述容器具体的为玻璃圆管，所述玻璃圆管的直径优选为0.15～0.2cm，更优选为0.15～0.19cm，最优选为0.17～0.18cm；所述玻璃圆管的长度优选为3.5～4.5cm，更优选为3.8～4.2cm，最优选为4cm。在本发明中，所述电活性物质为离子液体和单壁碳纳米管的混合物。本发明对所述离子液体和单壁碳纳米管的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所述熟知的离子液体和单壁碳纳米管即可，具体的可以为离子液体和单壁碳纳米管的市售产品。在本发明中，所述离子液体可以为任意种类的离子液体，在本发明实施例中所述离子液体具体的为N-十六烷基吡啶六氟磷酸盐，购于上海成捷化学有限公司。在本发明中，所述单壁碳纳米管的长度优选5～30μm，更优选为10～25μm，最优选为15～20μm；所述单壁碳纳米管的纯度优选>95％；所述所述单壁碳纳米管购于南京先丰纳米材料科技有限公司。在本发明中，所述离子液体和单壁碳纳米管的质量比优选为(93～97):(3～7)，更优选为95:5。本发明提供的复合电极还包括部分插入所述混合物中的导线。本发明对所述导线的材质没有特殊的限制，能够导电即可。在本发明中，所述导线优选为铜导线，所述铜导线的直径优选为0.05～0.13cm，更优选为0.08～0.11cm，最优选为0.1cm。在本发明中，所述导线伸入混合物内部的长度优选为0.5～1cm，更优选为0.6～0.9cm，最优选为0.7～0.8cm。本发明提供了一种所述复合电极的制备方法，包括以下步骤：将包含离子液体和单壁碳纳米管的混合物填满所述容器内部，然后进行加热处理；将导线的一端插入所述混合物中，得到所述复合电极。本发明将包含离子液体和单壁碳纳米管的混合物填满所述容器内部，然后进行加热处理。本发明优选对包含离子液体和单壁碳纳米管的混合物进行研磨，再将研磨后的混合物包含离子液体和单壁碳纳米管的混合物。本发明对所述研磨的速率没有特殊要求，能够使得离子液体和单壁碳纳米管混合均匀即可。本发明对所述研磨所用装置没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的研磨装置即可，具体的如研钵。在本发明中，所述研磨的时间优选为15～25分钟，更优选为18～23分钟，最优选为20分钟。经过所述研磨之后，离子液体和单壁碳纳米管的混合物呈灰色粉末状。在本发明中，所述加热处理的温度优选为85～95℃，更优选为88～93℃，最优选为90℃；所述加热处理的时间优选为1～5分钟，具体的可以为1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或5分钟。所述加热处理后，本发明将导线的一端插入所述混合物中，得到所述复合电极。在本发明中，所述导线以及插入的长度与上述技术方案所述一致，在此不再赘述。本发明还提供了一种利用上述技术方案所述复合电极检测河豚毒素含量的方法，包括以下步骤：提供待检测样品；以所述复合电极为工作电极，采用电化学间接酶联免疫的方法对待检测样品进行检测，得到电流差值；根据所述电流差值计算得到待检测样品中河豚毒素的含量。本发明提取待检鱼中的河豚毒素，制备待检测样品。在本发明中，所述提取的过程优选包含如下步骤：对待检鱼进行宰杀，分离鱼皮、鱼肉和内脏，所述内脏包括鱼肝和卵巢；对所述分离出的鱼皮、鱼肝和卵巢部位进行匀质和匀浆，得到浆液；将所述浆液与聚苯乙烯混合后进行分层处理，得到上清液；调节所述上清液的pH值至6.5～7.4，得到待检测样品。本发明对所述宰杀和分离的方法特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的鱼类的宰杀和分离方法即可。分离出鱼皮、鱼肝和卵巢部位后，本发明将所述鱼皮、鱼肝和卵巢部位进行匀质和匀浆。在本发明中，所述匀质优选具体为将鱼皮、鱼肝和卵巢部位混合均匀，所述匀浆优选为将鱼皮、鱼肝和卵巢部位的混合物进行打烂处理。本发明对所述打烂处理的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的打烂方法得到浆液即可。得到浆液后，本发明将所述浆液与聚苯乙烯混合后进行分层处理，得到上清液。在本发明中，所述浆液的质量与聚苯乙烯的体积之比优选为(3～7)g:(45～55)mL，更优选为(4～6)g:(48～53)mL，最优选为5g:50mL。在本发明中，所述分层处理优选为离心处理；所述离心处理的转速优选为3500～4500转/分，更优选为3800～4300转/分，最优选为4000转/分；所述离心处理的时间优选为3～7分钟，具体的可以为3分钟、4分钟、5分钟、6分钟或7分钟。得到上清液后，本发明调节所述上清液的pH值至6.5～7.4，得到待检测样品。本发明优选通过添加氢氧化钠来调节上清液的pH值，具体以氢氧化钠溶液的形式添加，所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度优选为0.5～1.5mol/L，更优选为0.8～1.3M，最优选为1M。在本发明中，所述上清液的pH值为6.5～7.4，具体的可以为6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3或7.4。得到待检测样品后，本发明以所述复合电极为工作电极，采用电化学间接酶联免疫的方法对待检测样品进行检测。在本发明中，所述电化学酶联免疫方法的具体过程优选为：将包含待检测样品与牛血清白蛋白偶联河豚毒素包被磁性微球的混合物与河豚毒素抗体混合，进行第一孵育；将所述第一孵育得到的产品进行洗涤；将所述洗涤后的产品与碱性磷酸酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白G混合进行第二孵育；将所述第二孵育得到的产品进行洗涤后磁分离，去除上清液；将所述去除上清液后的产品与缓冲溶液和四硝基苯磷酸二钠混合后进行电化学测定。将包含待检测样品与牛血清白蛋白偶联河豚毒素包被磁性微球的混合物与河豚毒素抗体混合，进行第一孵育。在本发明中，所述磁性微球可以为市售产品，也可以为自制产品。在本发明中，所述磁性微球的制备方法，优选包含如下步骤：将六水合氯化铁的乙二醇溶液与乙酸钠和聚乙二醇混合，得到混合体系；对混合体系进行加热处理，得到磁性微球。在本发明中，所述六水合氯化铁的乙二醇溶液的浓度优选为30～35g/mL，更优选为32～34g/mL，最优选为33.75g/mL。在本发明中，所述六水合氯化铁、乙酸钠和聚乙二醇的质量比优选为(1～3):(3～5):(0.5～2)，更优选为(1.2～2):(3.2～4):(0.8～1.5)，最优选为1.35:3.6:1。得到混合体系后，本发明将所述混合体系进行加热处理，得到磁性微球。在本发明中，所述加热处理的温度优选为180～220℃，更优选为190～210℃，最优选为200℃；时间优选为5～10小时，具体的可以为5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时。本发明优选对高温处理得到的产品进行洗涤。在本发明中，所述洗涤优选为用无水乙醇进行洗涤；所述洗涤的次数优选为3～5次，具体的可以为3次、4次或5次。本发明优选将得到的磁性微球溶于无水乙醇中得到磁性微球的无水乙醇溶液，待用；所述无水乙醇和乙二醇的体积比优选为1:(0.5～1.5)，更优选为1:1。在本发明中，所述牛血清白蛋白偶联河豚毒素包被磁性微球的制备方法优选包括以下步骤：使用一水吗啉乙磺酸(MES)对所述磁性微球的无水乙醇溶液进行稀释，得到稀释液；将所述稀释液与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)溶液混合，进行第三次孵育；将第三次孵育得到的磁性微球与牛血清白蛋白偶联河豚毒素(BSA-TTX)和MES混合，进行第四次孵育；对第四次孵育得到的包被微球进行屏蔽。本发明优选使用一水吗啉乙磺酸(MES)对所述磁性微球的无水乙醇溶液进行稀释，得到稀释液。在本发明中，所述一水吗啉乙磺酸的浓度优选为20～30mM，更优选为22～28mM，最优选为25mM。在本发明中，所述稀释液的浓度优选为45～55mg/mL，更优选为48～53mg/mL，最优选为50mg/mL。本发明优选将所述稀释液与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)溶液混合，进行第三次孵育。在本发明中，所述N-羟基丁二酰亚胺溶液的浓度优选为45～55mg/mL，更优选为48～53mg/mL，最优选为50mg/mL；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液的浓度优选为45～55mg/mL，更优选为48～53mg/mL，最优选为50mg/mL。在本发明中，所述N-羟基丁二酰亚胺溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液的体积比优选为1:(0.5～1.5)，更优选为1:1；所述N-羟基丁二酰亚胺溶液和乙二醇的体积比优选为1:(500～1000)，更优选为1:800。在本发明中，所述第三次孵育的时间优选为20～40分钟，更优选为25～35分钟，最优选为30分钟。本发明优选对第三次孵育得到的微球进行洗涤。在本发明中，所述洗涤优选为使用MES进行洗涤。本发明优选将磁性微球与牛血清白蛋白偶联河豚毒素(BSA-TTX)和MES混合，进行第四次孵育。在本发明中，所述牛血清白蛋白偶联河豚毒素(BSA-TTX)的浓度优选为50～150ng/mL，更优选为80～130ng/mL，最优选为100ng/mL。在本发明中，所述BSA-TTX和MES的体积比优选为(2～4):2，更优选为3:2；所述BSA-TTX和BHS的体积比优选为(2～4):1，更优选为3:1。在本发明中，所述第四次孵育的时间优选为20～40分钟，更优选为25～35分钟，最优选为30分钟。本发明优选对第四次孵育得到的包被微球进行屏蔽。在本发明中，所述屏蔽优选为使用磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)对包被微球的剩余位点进行屏蔽。在本发明中，所述PBS缓冲液的浓度优选为5～15mmol/L，更优选为8～13mM，最优选为10mM；所述PBS缓冲液中优选还包含2wt％的BSA。在本发明中，所述屏蔽的时间优选为1～3小时，具体的可以为1小时、2小时或3小时。本发明以所述复合电极为工作电极，采用电化学方法对待检测样品进行检测，得到电流差值，根据所述电流差值计算得到待检测样品中河豚毒素的含量。本发明所述检测是基于间接酶联免疫(ELISA)进行的。本发明将待检测样品与负载了牛血清白蛋白偶联河豚毒素的磁性微球混合，然后再与河豚毒素抗体(Anti-TTX)混合，进行孵育。在本发明中，所述待检测样品与负载了牛血清白蛋白偶联河豚毒素的磁性微球的体积比优选为100:(20～40)，更优选为100:30；所述待检测样品和Anti-TTX的体积比优选为1:(0.5～1.5)，更优选为1:1。在本发明中，所述Anti-TTX的浓度优选为50～150ng/mL，更优选为80～130ng/mL，最优选为100ng/mL。在本发明中，所述第一次孵育的温度优选为35～40℃，更优选为36～39℃，最优选为37～38℃；时间优选为25～35分钟，更优选为28～33分钟，最优选为30分钟。本发明用PBST对得到的孵育体系进行洗涤后，与碱性磷酸酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白G混合，进行第二次孵育。在本发明中，所述碱性磷酸酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白G购于上海浩晔生物技术有限公司。在本发明中，所述碱性磷酸酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白G与待检测样品的体积比优选为1:(0.5～1.5)，更优选为1:1。在本发明中，所述第二次孵育的温度优选为35～40℃，更优选为36～39℃，最优选为37～38℃；时间优选为25～35分钟，更优选为28～33分钟，最优选为30分钟。所述第二孵育后，本发明将所述第二孵育得到的产品进行洗涤后磁分离。述磁分离后去除得到的上清液，再与缓冲溶液和四硝基苯磷酸二钠混合进行电化学测定。在本发明中，所述四硝基苯磷酸二钠(PNPP)为底物；所述底物和待检测样品的体积比优选为1:(0.5～1.5)，更优选为1:1；所述底物的浓度优选为0.1～0.3mol/L，更优选为0.2M。在本发明中，所述检测以上述技术方案所述的复合电极作为工作电极，具体的采用三电极体系，分别为工作电极、参比电极和对电极。在本发明中，所述参比电极优选为氯化银参比电极，对电极优选为铂丝。在本发明中，所述电化学方法优选为安培时间法；所述安培时间法的检测电位优选为+0.7～+0.8V，更优选为+0.75V；扫描速率优选为0.01～0.02V/s。所述电化学检测后得到电流差值，本发明根据所述电流差值计算得到待检测样品中河豚毒素的含量。本发明提供了一种复合电极及检测河豚毒素含量的方法。本发明复合电极，包含电活性物质盛放容器、置于所述容器内的离子液体和单壁碳纳米管的混合物以及部分伸入所述混合物内部的导线。本发明提供的检测河豚毒素含量的方法，包括以下步骤：提供待检测样品；以所述复合电极为工作电极，采用电化学方法对待检测样品进行检测，得到电流差值；根据所述电流差值计算得到待检测样品中河豚毒素的含量。根据实施例的实验结果可知，本发明提供的检测方法将电化学和免疫学相结合，能够在20分钟以内测定待测样品中的河豚毒素的实际含量。此外，本申请提供的电化学方法与光学法的检测结果基本一致，证明本申请提供的检测方法具有较高的准确度。下面结合实施例对本发明提供的复合电极及检测河豚毒素含量的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1制备复合电极：按质量比95:5称取离子液体和单壁碳纳米管，并在研钵中研磨混合20min后，用药匙将混合物塞进直径为1.8mm、长度为4cm的玻璃管中，并将玻璃棒中混合物塞紧。然后，将这根玻璃管放进90℃的烘箱内烘3min，待离子液体熔化后，将一根直径为0.1cm导电用的铜丝插入玻璃管内，插入深度为0.5cm待冷却，即得复合电极，电极表面可以直接用称量纸磨平。实施例2待检测样品的制备：从当地市场采集样品后进行宰杀，分离鱼皮、鱼肉与内脏，将鱼皮、鱼肝和卵巢部位切成小块并进行均质。将5克匀浆后的样品加入到含有50mL聚苯乙烯的离心管中，混合振荡3min。将混合物离心5min(4000转/分)，上层清液用1M氢氧化钠调节pH值为7，振荡30s，得到待检测样品，在4℃保存备用。空白样本取自鱼肉部分。本发明共选择了五条不同的河豚，分别提取得到待检测样品1、待检测样品2、待检测样品3、待检测样品4和待检测样品5。实施例3磁性微球的制备:将1.35g六水合氯化铁溶解于40mL乙二醇中，搅拌30min，继续加入3.6g乙酸钠和1g聚乙二醇(PEG20000)，充分混匀60min，放入50mL密封罐中，200℃反应8h，随后用水迅速冷却至室温。再用无水乙醇洗涤四次，最后将磁性微球溶于40mL无水乙醇中，待用。BSA-TTX在磁性微球上的固定：合成的磁性微球用25mM的MES稀释至50mgmL-1，然后加入50μLNHS(50mgml-1)和50μLEDC(50mgml-1)，缓慢旋转，室温下孵育30min。用300μLMES洗涤磁性微球两次，用磁分离去除上清液。随后在100μLMES(pH6.0)中加入150μLBSA-TTX(100ngmL-1)，混匀后加入磁性微球中，室温下孵育30min。包被BSA-TTX后的磁性微球用10mMPBS缓冲液，内含2％BSA(pH7.4)来屏蔽磁球上其余位点，室温下孵育2h。磁球经过再次磁分离去除上清液后，储存于10mMPBS缓冲液(pH7.4)，于4℃保存备用。实施例4电化学免疫分析：将100μL待检测样品与30μL已固定的BSA-TTX磁球一同加至200μL离心管中，再加入100μLAnti-TTX，37℃反应1h。用15mMPBST洗涤三次，加入100μL碱性磷酸酶，37℃孵育30min。用15mMPBST洗涤三次，再经过磁分离，去除上清液，加入Tris缓冲液平衡5min，将液体移至电化学工作站。打开软件CHI440，20分钟以内获得实验结果，再对数据进行计算，最终得到河豚毒素的含量。在本发明中，所得的实验最初结果是电化学电流变化曲线，进而计算得出电流变化曲线上电流差值，即终止时电流值与初始时电流值之差。本发明首先利用TTX标准品(浓度分别为0ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、15ng/mL和45ng/mL)，以TTX浓度(ng/mL)为横坐标，以电流变化(μA)为纵坐标，得到一条标准曲线，即y＝-0.1356x+8.6302(R2＝0.9913)。本发明实际测得的电流差如表1所述，本发明将实际样本检测时得到的电流差值代入标准曲线方程中，即得到在实际样本中的TTX浓度。表1待检测样品检测得到的电流差值样品电流差值(μA)17.75±0.0328.13±0.0237.72±0.0247.50±0.0357.56±0.02本发明还使用光学法对上述待检测样品1、待检测样品2、待检测样品3、待检测样品4和待检测样品5中的河豚毒素的浓度进行了检测，本发明提供的电化学方法和光学法的检测结果具体的如表2所示。表2电化学方法和光学法对待检测样品进行检测的结果比较根据表2的测试结果可知，本申请提供的电化学方法与光学法的检测结果基本一致，证明本申请提供的检测方法具有较高的准确度。由以上实施例可知，本发明提供了一种复合电极及检测河豚毒素含量的方法。本发明复合电极，包含电活性物质盛放容器、置于所述容器内的离子液体和单壁碳纳米管的混合物以及部分伸入所述混合物内部的导线。本发明提供的检测河豚毒素含量的方法，包括以下步骤：提供待检测样品；以所述复合电极为工作电极，采用电化学方法对待检测样品进行检测，得到电流差值；根据所述电流差值计算得到待检测样品中河豚毒素的含量。根据实施例的实验结果可知，本发明提供的检测方法将电化学和免疫学相结合，能够在20分钟以内测定待测样品中的河豚毒素的实际含量。此外，本申请提供的电化学方法与光学法的检测结果基本一致，证明本申请提供的检测方法具有较高的准确度。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3