一种活体在线检测植物玉米素的微电极生物传感器及其应用的制作方法

本发明涉及微电极生物传感技术，具体地说，涉及一种活体在线检测植物玉米素的微电极生物传感器。

背景技术：

玉米素是一种天然的植物体细胞分裂素，作为重要的植物生长调节激素，在植物体内参与各种生物过程，包括细胞的分裂与分化，根、芽的形成与生长、损伤后的再生等，还可影响植物的光合作用和抗逆性。因此，关于玉米素的生理学机能，例如合成、降解、代谢路径以及与其他激素之间的相互作用的研究成为重要课题，但是进一步确定玉米素对植物生长的作用还需要准确的定量分析方法，如何实时、可靠地对植物中微量的玉米素进行定性定量分析，是这些研究开展中重要的一步。

激素在植物中的含量极低，性质又不稳定，加之细胞中其他化合物的干扰，故测定的方法必须十分灵敏和专一。随着检测方法的发展，已形成了生物鉴定法、理化检测法和免疫检测法三大检测体系。生物鉴定法虽然简单但是容易受到交叉反应的干扰，且测定周期长；而免疫法中使用的抗体不容易得到、成本高，样品破坏性大；理化分析又以各类色谱法最为常见，但此法对样品处理复杂，仪器昂贵，实验条件苛刻。尤其是这些方法对植物样本进行破坏性的处理，无法获取即时有效的玉米素浓度，无法对植物生长过程中实现实时在体监测，因此亟需一种可对植物活体进行原位动态检测的灵敏度高、操作简便的电化学分析法。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种活体在线检测植物玉米素的微电极生物传感器及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种检测植物玉米素的微电极生物传感器，所述微电极生物传感器包括绝缘基底与通过MEMS工艺设置在绝缘基底上的微电极，所述微电极包括工作电极、参比电极与对电极；

其中，所述工作电极为碳纳米管与聚吡咯修饰的铂黑电极。

本发明利用碳纳米管与聚吡咯修饰的铂黑电极对植物玉米素进行检测，由于碳纳米管对玉米素具有催化氧化作用，同时具有大的比表面积能够获得较大的响应电流和较好的灵敏度；而聚吡咯膜具有良好的导电性，并且能吸附结合碳纳米管，同时表现出增强催化效果，提高电极的稳定性，得到特异性良好、灵敏度高的检测植物玉米素的工作微电极，进而可用于植物活体在线检测玉米素。

进一步地，所述工作电极的修饰方法为：将表面干净的铂黑电极浸入含有吡咯和羟基化碳纳米管的支持电解液中，通过循环伏安法在-0.2～0.8V，扫描速度为10～200mV/s(优选50mV/s)的条件下进行电聚合沉积，得到碳纳米管与聚吡咯修饰的铂黑电极。

进一步地，所述支持电解液中吡咯的浓度为0.01～5M，羟基化碳纳米管的浓度为0.01～50mg/mL。

作为优选，所述支持电解液中吡咯的浓度为0.2M，羟基化碳纳米管的浓度为6mg/mL。将铂黑电极浸入含有该吡咯浓度和羟基化碳纳米管浓度下的支持电解液中利用循环伏安法进行电化学聚合，所述吡咯优选浓度能够较好地控制吡咯电聚合速度，使之成膜不易被破坏，同时能够吸附结合上碳纳米管而不影响其导电性。所述羟基化碳纳米管优选浓度能够有效地增大电极表面积，增强电极催化性能，同时保证聚吡咯/碳纳米管复合膜的均匀性和电子传递效率。

更进一步地，所述支持电解液为酸性溶液，即pH值小于7，且需含有不超过5M的氯离子。作为优选，含有0.2M氯化钾和0.1M硫酸。氯化钾为提供氯离子的电解质，硫酸的作用为提供酸性的电解质溶液，上述浓度可使电聚合有效地发生。

进一步地，为了使所述微电极生物传感器适用于植物活体的在线检测，避免离体检测对样品的破坏和取样过程中样品的变化和损失，本发明优选所述绝缘基底具有用于穿刺植物组织的尖端部分，实现植物活体的在线检测。所述植物组织可为植物的根、茎、叶或果实等。

具体而言，所述绝缘基底呈三棱型结构，三面绝缘基底上分别设置工作电极、参比电极与对电极。所述电极材料设置在绝缘基底的一端，另一端设置有导电元件用于连接电化学工作站。

为了实现对植物活体的在线检测，所述微生物生物传感器需具有穿刺植物组织的能力，因此，所述绝缘基底具有用于穿刺植物组织的尖端部分，所述尖端部分的长度可根据所需穿刺的厚度进行调整。作为优选，所述绝缘基底的总长度为1～10cm，尖端部分长度为2～20mm，基底的宽度为2～20mm，厚度为0.1～2mm。在本发明的一个具体实施方式中，所述绝缘基底的规格为：总长度为5cm，尖端部分长度为5mm，每面绝缘基底宽度为3mm，每面绝缘厚度为0.5mm。

所述绝缘基底可选自硅片、不锈钢、有机玻璃等。

第二方面，基于上述微生物传感器的结构和修饰后的工作电极，本发明还提供了前述微电极生物传感器在检测植物玉米素方面的应用。

具体包括如下步骤：

1)分别配制浓度为0、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、30、50μM的玉米素-磷酸缓冲(pH＝6.0)溶液，使用所述微电极生物传感器进行差分脉冲伏安法检测(电位0.7～1.1V，电位增加0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.02s，脉冲周期0.5s，静止时间20s)，得到一组浓度与扣除背景电流的峰电流的关系曲线，制作工作曲线，线性方程为i＝1.84+0.105c(电流单位μA，浓度单位μM)，线性范围可达0.5～50μM；

2)清洗所述微电极生物传感器后，首先分别检测三份标准浓度(3，15，30μM)玉米素溶液进行电化学校准，计算工作曲线与标准曲线斜率偏差如在15％以内，认为电极可正常工作，得到校准后的工作曲线；

校正后对待测样品进行差分脉冲伏安扫描(电位0.7～1.1V，电位增加0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.02s，脉冲周期0.5s，静止时间20s)，活化20min后，稳定测试5min后，获得的电流信号通过校正后的工作曲线计算得到待测样品中玉米素的即时浓度。

进一步地，所述待测样品为植物的根、茎、叶或果实。

本发明的有益效果在于：

本发明利用碳纳米管与聚吡咯修饰的铂黑电极作为工作电极检测植物玉米素，表现出良好的电极稳定性和催化氧化活性，检测范围可达0.5～50μM，检测限为0.1μM。对植物体内其他干扰物质如吲哚乙酸、水杨酸、葡萄糖等产生的响应信号较弱，该电极表现出了良好的特异性。

进一步地，本发明还实现了植物体中玉米素的在线监测，真实的对玉米素信息的同步获取，获得更多活体的、动态的、即时玉米素的信息，为植物生命活动规律、揭示植物生命现象本质提供更多的理论依据。本发明相对于传统的生物鉴定、化学检测方法来说，该方法样品前处理简单、微创性损伤，检测方法直接可靠快速简单。

附图说明

图1为本发明所述微电极生物传感器示意图。

图2为本发明所述微电极生物传感器的工作电极示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1微电极生物传感器

1、微电极通过MEMS工艺设置在绝缘的有机玻璃基底上，基底具有尖端部分用于穿刺植物组织，总长度为5cm，尖端部分长度为5mm，基底的宽度为3mm，厚度为0.5mm；每个基底上一端设置有用于连接导电的元件，另一端为检测用的电极材料，如图1所示；其中参比电极为Ag/AgCl，对电极为铂，工作电极为铂黑。

所述绝缘基底呈三棱型结构，三面绝缘基底上分别设置工作电极、参比电极与对电极。所述电极材料设置在绝缘基底的一端，另一端设置有导电元件用于连接电化学工作站。

2、用氧化铝粉末在金相砂纸抛光工作电极，分别用去离子水、乙醇超声清洗干净。随后将微电极置于0.5M稀硫酸溶液中进行循环伏安扫描(0～1.5V)得到典型的循环伏安谱图，确保电极表面干净。

3、配制0.2M吡咯/0.2M氯化钾/6mg/ml羟基化碳纳米管0.1M硫酸溶液，置入微电极在-0.2～0.8V、50mV/s下通过循环伏安法进行电聚合沉积10min，后用去离子水清洗干净，得到修饰的聚吡咯碳纳米管/铂黑电极，如图2所示。

实施例2微电极生物传感器的应用

待测玉米为北京市农林科学院温室种植的“京科968”，选取两株玉米幼苗的嫩茎为检测样本。清洁后，将微电极插入玉米幼苗嫩茎处，开始电化学检测。

1、分别配制浓度为0、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、30、50μM玉米素-磷酸缓冲溶液(pH＝6.0)，使用实施例1制备的微电极生物传感器进行差分脉冲伏安法检测(电位0.7～1.1V，电位增加0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.02s，脉冲周期0.5s，静止时间20s)，得到一组浓度与扣除背景电流的峰电流的关系曲线，制作微电极工作曲线，线性方程为i＝1.84+0.105c(电流单位μA，浓度单位μM)，线性范围可达0.5～50μM。

2、微电极在清洗后，首先分别检测三份标准浓度(3，15，30μM)玉米素溶液进行电化学校准，计算工作曲线与标准曲线斜率偏差如在15％以内，认为电极可正常工作。校正后对样品进行差分脉冲伏安扫描(电位0.7～1.1V，电位增加0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.02s，脉冲周期0.5s，静止时间20s)，活化20min后，稳定测试5min后，获得的电流信号通过校正后的工作曲线计算得到被测样品的即时浓度。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于：将实施例1中的吡咯替换为苯胺修饰工作电极。

1、微电极的构造：同实施例1。

2、工作电极预处理：同实施例1。

3、配制0.2M苯胺/0.05M氯化钾/6mg/ml羟基化碳纳米管/0.1M硫酸溶液，置入微电极在-0.2～0.8V、50mV/s下通过循环伏安法进行电聚合沉积10min，后用去离子水清洗干净，得到修饰的聚苯胺碳纳米管/铂黑电极。

4、将步骤3中得到的聚苯胺碳纳米管/铂黑微电极置于5μM玉米素-磷酸缓冲(pH＝6.0)溶液中，进行差分脉冲伏安法检测(电位0.7～1.1V，电位增加0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.02s，脉冲周期0.5s，静止时间20s)，在电位从+0.7到+1.1V的范围内仅观察到一个弱而宽的氧化峰，峰电流约为0.1826μA，低于实施例中的电极检测同样品的峰电流2.365μA，灵敏性更差，说明对比例1的微电极对玉米素的电催化氧化活性很差，说明聚吡咯在伏安响应中协同增强了电催化活性。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于：将实施例1中修饰工作电极的吡咯浓度替换为0.8M。

1、微电极的构造：同实施例1。

2、工作电极预处理：同实施例1。

3、配制0.8M吡咯/0.05M氯化钾/6mg/ml羟基化碳纳米管/0.1M硫酸溶液，置入微电极在-0.2～0.8V、50mV/s下通过循环伏安法进行电聚合沉积10min，后用去离子水清洗干净，得到修饰的聚吡咯碳纳米管/铂黑电极。

4、对步骤3中得到的聚吡咯碳纳米管/铂黑微电极置于5mM铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中进行交流阻抗表征时发现，获得的阻抗图谱计算的阻抗值大于实施例中工作微电极的阻抗值，说明0.8M的吡咯聚合修饰得到了一个较实施例更厚的聚吡咯膜，致使膜的导电性下降。

5、将步骤3中得到的聚吡咯碳纳米管/铂黑微电极置于5μM玉米素-磷酸缓冲(pH＝6.0)溶液中，进行差分脉冲伏安法检测(电位0.7～1.1V，电位增加0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.02s，脉冲周期0.5s，静止时间20s)，在电位从+0.7到+1.1V的范围内仅观察到一个弱小的氧化峰，峰电流约为0.843μA，低于实施例中的电极检测同样品的峰电流2.365μA，灵敏性较差，说明对比例2的微电极对玉米素的催化效果较差，说明0.8M的吡咯在修饰过程中影响了碳纳米管的固定的均匀性，在伏安响应中影响了底物在膜上的扩散从而影响到电极检测效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。