快速观察拟南芥胚珠形态及统计外珠被细胞数目的方法与流程

本发明属于生物学领域，涉及一种快速观察拟南芥胚珠形态及统计外珠被细胞数目的方法。

背景技术：

胚珠是植物雌性生殖器官，是受精后发育为种子的结构，因此胚珠发育是否正常，直接决定了植物能否形成种子繁衍后代。成熟胚珠由几个特化的部分组成，包括孢子体组织（珠柄、珠被、珠心）和雌配子体组织（胚囊）。裸子植物一般只有一个珠被（integument）结构覆盖珠心形成封闭结构，而被子植物的胚珠通常包括两个珠被结构，即由外珠被和内珠被包裹珠心和胚囊(kelleyandgasser,2009)。胚珠受精后，珠被发育成种皮，对保护胚胎、种子传播和种子发芽具有重要作用。而在胚珠发育过程中，珠被发育对胚珠轴向的建立和形态建成具有重要作用。胚珠发育过程中，孢子体和配子体之间存在信号交流，珠被发育缺陷往往导致胚囊裸露或胚囊发育异常，最终影响胚珠的受精而形成败育(loraetal.,2011;yadegarianddrews,2004)。

拟南芥的胚珠很小，而且隐藏在雌蕊的中心，在观察胚珠形态和统计外珠被细胞数目时要先将胚珠外面的组织器官去掉，只留下整个完整的胚珠进行观察。现在国内外常用的方法主要有一下的几种方法：①电子显微镜扫描的方法：先将组织材料固定在4%（v/v）的戊二醛的磷酸缓冲液（25mm，ph=7.0）中过夜，然后再将样品置于1%的四氧化锇磷酸缓冲液（25mm，ph=7.0）中，在4℃冰箱中放置4-5天，然后再进行电子显微镜扫描，成像后观察胚珠珠被的形状；②透明-干涉观察方法：先将胚珠或者雌蕊固定在（福尔马林:乙醇:乙酸:水=1:0.5:5:3.5）的固定液中过夜，然后用胚珠放置在含有透明液（水合氯醛:甘油:水=8:1:2）的载玻片上，盖上盖玻片，然后在olympus显微镜上观察胚珠的形态；③石蜡切片的方法：先用faa固定液将胚珠或者雌蕊固定，然后用65%到100%系列浓度的乙醇溶液逐级脱水；无水乙醇到纯二甲苯逐级透明；将低熔点的石蜡蜡屑放入盛有1/2二甲苯的小瓶中，直到二甲苯完全饱和；在40℃下浸蜡24h，然后用由混合石蜡在温箱中60℃保温浸蜡，每天换两次混合蜡液，共72-120h；包埋，进行厚度6-8µm切片，2%明胶粘片，在35℃水浴锅上2h展片，之后再将载玻片放入38℃烘箱中烘干，用纯二甲苯30℃保温脱蜡40min，晾干切片；封片。最后在显微镜底下观察胚珠的形态并且统计外珠被的细胞数目。

但是目前的这几种方法在胚珠形态观察和外珠被细胞数目统计方面，操作起来需要的时间比较长，过程比较的繁琐，同时相对而言效果一般，而且有的方法只能顾及一个方面的效果，如电子显微镜扫描的方法和dic显微镜观察方法能够看到胚珠和珠被的形态，但是在外珠被细胞数目统计上不占优势。因此，目前还没有一种能够快速有效的观察拟南芥胚珠形态和统计外珠被细胞数目的方法。

技术实现要素：

针对目前还没有一种能够快速、有效地观察拟南芥胚珠形态和统计外珠被细胞数目方法的问题，本发明提供的一种一种快速观察拟南芥胚珠形态及统计外珠被细胞数目的方法，能够快速有效观察拟南芥胚珠形态和统计外珠被细胞数目的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）溶液的配制：配制1‰w/v荧光增白剂溶液和浓度为2m的氢氧化钾的溶液；

（2）材料的获得：取刚要露白的拟南芥花苞放置在贴有双面胶的载玻片上，用注射器的针头挑取拟南芥的胚珠；

（3）玻片制备：吸取1‰w/v荧光增白剂10µl置于载玻片上，将步骤（2）所得胚珠连同胎座置于荧光增白剂液滴上，再加入2m的氢氧化钾溶液10µl，用移液枪轻轻混匀，盖上盖玻片；

（4）孵育：将步骤（3）制备好的玻片在室温中放置10-15分钟，让荧光增白剂充分渗透进入拟南芥的胚珠中；

（5）confocal显微镜拍照：将步骤（4）所得孵育好的玻片放置在confocal显微镜下，用波长范围在100～400nm之间的紫外线观察，并拍照；

（6）外珠被细胞数目统计：统计步骤（5）所得照片中的外珠被细胞数目。

其中，步骤（1）所述荧光增白剂为calcoflourwhite,cat.no.c-clfr10。

本发明的显著优点：

本发明的方法是一种观察拟南芥胚珠形态和统计外珠被细胞数目的方法，和之前的方法相比，能够快速的有效的观察拟南芥胚珠形态和统计外珠被细胞数目。

附图说明

图1本发明方法观察到的拟南芥胚珠的形态

图2透明-干涉方法观察到拟南芥胚珠的形态。

具体实施方式

实施例1

一种快速观察拟南芥胚珠形态及统计外珠被细胞数目的方法，其步骤如下：

（1）溶液的配制：准备好高压灭菌过的双蒸水，然后用高压过的无菌水配制1‰w/v的calcoflourwhite荧光增白剂溶液（cat.no.c-clfr10）和浓度为2m的氢氧化钾的溶液；

（2）材料的获得：取刚要露白的拟南芥的花苞放置在贴有双面胶的载玻片上，用注射器的针头拨开花瓣和雄蕊，然后切下柱头，再用针头把拟南芥雌蕊的心皮部分从中间剖开，最后用针头将胎座上的胚珠取下来；

（3）玻片制备：用10µl的移液枪吸取1‰w/v荧光增白剂10µl放在载玻片上，然后用将上面所获得的胚珠连同胎座放到荧光增白剂上面，再加入10µl的2m的氢氧化钾的溶液，用移液枪轻轻的混匀一下，最后轻轻的盖上盖玻片；

（4）孵育：将步骤（3）制备好的玻片在室温中放置10-15分钟，让荧光增白剂充分渗透进入拟南芥的胚珠中；

（5）confocal显微镜拍照：将步骤（4）中孵育好的玻片放置在confocal显微镜下，用波长范围在100～400nm之间的紫外线观察，然后拍照；

（6）外珠被细胞数目统计：统计步骤（5）所得照片中的外珠被细胞数目；

使用本方法所得拟南芥的胚珠形态如图1所示，外珠被统计数据见表1；图2为透明-干涉方法观察到拟南芥胚珠的形态。

表1本发明方法统计外株被实验数据

比较图1和图2，可知本发明方法制片可使得拟南芥的胚珠形态和外珠被的细胞数目更加清晰清晰，说明本实施方式比透明-干涉方法获得的结果更加优异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：

技术总结
本发明提供一种快速观察拟南芥胚珠形态及统计外株被细胞数目的方法，其利用荧光漂白剂处理拟南芥的胚珠，在共聚焦显微镜和普通光学显微镜下可以快速及时、快速地对拟南芥胚珠珠被细胞的数目进行统计。相比普通的切片及干涉差‑透明的方法要简便，而且效果更好。

技术研发人员：秦源;蔡汉阳;张曼;赵丽华;王路路
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：2017.03.09
技术公布日：2017.07.14